2018 Fiscal Year Research-status Report
Study of regulatory system for anesthetic efficacy using GABA-A receptor plasticity
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18K08846
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
上野 伸哉 弘前大学, 医学研究科, 教授 (00312158)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古川 智範 弘前大学, 医学研究科, 助教 (60402369)
櫛方 哲也 弘前大学, 医学研究科, 准教授 (80250603)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | GABA－A受容体 / 麻酔薬 / 受容体トラフィッキング / 受容体リン酸化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
GABA-A受容体リン酸化と細胞内トラフィッキングとの関連を解析した。神経系細胞であるNeuro2A細胞株を用い、GABA-A受容体beta3サブユニットに蛍光物質Super ecliptic pHluorin(SEP）蛋白質を導入した発現用プラスミドを作成した。さらワイルドタイプ（WT)beta3サブユニットのリン酸化候補部位をアミノ酸配列より予想した。予想部位（S408,S409)の配列に遺伝子変異導入（S408A,S409A)し、リン酸化を受けないプラスミドを作成した。WTbeta3サブユニットと変異導入beta3サブユニットをそれぞれNeuro2A細胞にトラスフェクションし、その受容体分布変化を、SEP蛍光を指標にしてレーザーコンフォーカル顕微鏡にて観察した。WTのbeta3サブユニット導入細胞では、タンパク質合成後に、細胞形質膜に一致してSEP蛍光の集積が見られた。一方リン酸化部位に変異導入したbeta3サブユニット発現細胞では、タンパク質合成されても、SEP蛍光は、ほとんど細胞質内，特に核周囲に集積していた。以上のことより、beta3サブユニットのリン酸化がGABA-A受容体の形質膜移行を制御することが示された。GABA-A受容体beta3サブユニットは、alphaおよびgammaサブユニットと小胞内で結合しGABA-A受容体機能を得て膜移行すると考えられており、その移行部分でのリン酸化制御が明らかとなった。また個体レベルでのアプローチとして、GABA-A受容体のトラフィッキングに関与するPRIP-1タンパク質の欠損動物において、静脈麻酔薬propofolによる正向反射の低下、催眠効果減弱をすでに報告している。さらに脳波レベルにおいてpropofolの効果減弱を解析し、投稿した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GABA-A受容体のリン酸化と細胞内分布、トラフィッキングとの関連、また受容体のどの部位のリン酸化がトラフィッキング制御に係るかを明らかとした点は当初の目的のひとつであり、初年度の進捗状況としてほぼ予定どおりである。
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| Strategy for Future Research Activity |
GABA-A受容体のbetaサブユニットのリン酸化が形質膜移行を制御することがあきらかとした。一方、GABA-A受容体はGABAが結合しClイオン透過させるチャネルとして機能するには、alpha＋betaもしくはalpha＋beta＋gamma 異なるサブユニットとヘテロマーを形成する必要がある。この組み合わせにおいてトラスフェクションし、betaサブユニットにはSEP導入させて、細胞内のトラフィッキング機能を、レーザーコンフォーカル顕微鏡にて解析する。またSEP導入したサブユニットを発現しても、GABA-A受容体として機能することを電気生理学的に確認する。
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