2018 Fiscal Year Research-status Report

リアルタイム可視化アッセイによるオピオイド受容体細胞内動態解析と新規鎮痛法の開拓

Research Project

Project/Area Number	18K08858
Research Institution	Nagasaki University
Principal Investigator	村田寛明長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 准教授 (90437856)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	上園保仁国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (20213340) 宮野加奈子国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 研究員 (50597888)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	オピオイド受容体 / 脱感作
Outline of Annual Research Achievements	まず、In vitro実験として、CellKeyシステムを用いたGPCR活性スクリーニングを実施した。オピオイド鎮痛薬併用実験の組み合わせとしてレミフェンタニル（RF）とフェンタニル（FEN）を選択した。また、オピオイド鎮痛薬と組み合わせる非オピオイド鎮痛薬としてアセトアミノフェン（APAP）およびその代謝産物であるAM404を用い、RF+APAP, FEN+APAP, RF+AM404, FEN+AM404の併用を選択した。 μオピオイド受容体を過剰発現したHEK293細胞株（Halo-MOR/HEK293）にRFとFENの混合割合を変化させて投与し、GPCR活性スクリーニングを実施した。10nMおよび100nMの2種類の濃度でRFとFENの混合割合を0:10から10:0まで11段階に変化させ、μオピオイド受容体アゴニストであるDAMGO処置によるGPCR活性と比較検討した。その結果、いずれの濃度・混合割合においても、DAMGOにより生じるGPCR活性と比較して有意な変化は生じなかった。引き続き、脱感作への影響を検討するためHalo-MOR/HEK293をRF/FEN混合液で2回処置しGPCR活性を評価した。RF単独では10nMおよび100nMのいずれにおいてもvehicleと同様に2回目処置後のGPCR活性は1回目処置後のGPCR活性と比較して減弱しなかった。一方、FENでは100nMにおいて2回目の処置後にGPCR活性の有意な減弱を認めた。すなわち、脱感作が生じている可能性を示唆するデータが得られた。現時点では統計学的解析は実施できていないが、RFとFENを混合して処置した場合、FENの割合が高いほど脱感作を生じやすい傾向を認めている。オピオイド鎮痛薬＋非オピオイド鎮痛薬の組み合わせによる実験は、上記4種類について解析中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 当初の計画では、CellKeyを用いたGPCR活性スクリーニング実験に関して、オピオイド鎮痛薬の併用およびオピオイド鎮痛薬＋非オピオイド鎮痛薬それぞれの組み合わせパターンをさらに増やしてデータを蓄積する予定であった。しかし、主要な組み合わせであるRF＋FENおよびRF+APAP, FEN+APAP, RF+AM404, FEN+AM404について実験を開始したところ、比較的高濃度のFENでは脱感作が生じる一方で同濃度のRFでは脱感作が生じないという結果が得られた。この結果は当初想定していなかったものであるため、実験結果を慎重に検討する対応をとった。その影響で進捗に若干の遅れが生じている。オピオイド鎮痛薬＋非オピオイド鎮痛薬の解析についても同様の対応を行なっている。
Strategy for Future Research Activity	CellKeyを用いたGPCR活性スクリーニング解析は、これまでに得られた結果について再現性を確認するとともに、新たな組み合わせについても順次スクリーニングを継続していく。特にFENの脱感作に関するデータおよびFEN単独で生じる脱感作に影響を与えうる組み合わせについては、本研究課題の重要なデータとなりうるため重点的にデータ解析を行う予定である。リアルタイム可視化アッセイはCellKeyでのスクリーニングの結果を踏まえて実施する予定であり、2019年度中には開始する計画である。リアルタイム可視化アッセイに用いる電子顕微鏡システムがより高性能のものに更新されたため、GPCR活性スクリーニングと並行して新システムでの最適なリアルタイム可視化アッセイのプロトコール確立を進める。
Causes of Carryover	本年度に予定していたリアルタイム可視化アッセイ実験を実施する回数が少なかったため、試薬等に使用する予算を必要としなかった。一方で、実施回数が想定より多かったCellKeyアッセイに用いる器材等は追加購入を必要としなかった。次年度は、リアルタイム可視化アッセイの実施回数が増えることが想定されるため、そこに次年度使用額を充当する予定である。