2018 Fiscal Year Research-status Report
石灰化スコア分類に基づく頚動脈粥腫安定化機構解明のためのオミックス解析の展開
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18K08977
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
片野 広之 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (30295612)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | carotid stenosis / carotiid plaque / calcium score / carotid endarterectomy / while exome sequencing |
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| Outline of Annual Research Achievements |
頸動脈内膜剥離術(CEA)にて摘出した10粥腫について、まずカルシウム(Ca)スコアをもとに高石灰化プラーク群と低石灰化プラーク群の2群に分けた。核酸を抽出後、全エクソーム(Whole Exome)を濃縮後、シーケンスライブラリーを作成した。品質検定後、次世代シーケンサー(NGS) はHiSeq2500 (Illumina)を採用して塩基配列を取得した。情報解析としてGATK UnifiedGenotyperによりエクソームターゲット領域上の一塩基多型（SNV・SNP), 挿入・欠失Indel変異を検出した。dbSNPのHGVDと1000Genomes ProjectのExACを付与し変異を絞り込み、SnpEff, VCF tools (Annotation Impact)およびClinVar (Pathogenic)を考慮した上で、dbNSFPに収載のミスセンス変異mutation影響度予測値としてFATHMM score を採用した。取得した塩基配列は品質スコアquality score 30以上の塩基が91.8-94.5%と良好であった。BMA-MEMによりUCSC hg19へマッピング（99.6-99.7%）し、重複Duplicateリードを除去した(ユニーク率95.6-96.5%)。平均カバー率(＞10x)は97.6%であった。Genedata Profiler ゲノム ソフトウェアを用いてゲノム変異解析を行った。エクソームターゲット領域上の総一塩基多型SNV(SNP)数は1標本あたり115,982-126,947、挿入Ins数は6,722-7,794、欠失Del数は8,739-10,006であった。最も頻度の高いSNVはG＞A, 次いでA＞G,C＞T,T＞C であった。挿入は(G)InsC, (A)InsGが、欠失は(CT)delC, (GC)delGが高頻度であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成３０年度は計画ではヒト頚動脈プラークは、頚動脈内膜剥離術によって摘出した標本（-80℃凍結）を用い、石灰化含有度の評価は術前MDCTAで計測したカルシウムスコアおよびHE染色組織標本で行い、高石灰化と低石灰化プラーク群に分類 (Stroke 2007, JSCVD 2014,2017 in press)、ゲノムDNAは上記採取した新鮮凍結組織を、DNA分離キット(Qubit,Invitrogen)を用いて抽出し、ターゲットの遺伝子をこれまでの研究においても使用した石灰化に関わる15遺伝子（OPG, MSX2 etc.）および血管新生促進・抑制に関わる57遺伝子(VEGF, FGF, ANGPTLs etc.) 計72遺伝子とし、Ion Ampliseq Customer Panel, Ion Ampliseq Library Kit (ver.2.0)を利用しライブラリーを作成した後、Ion Torrent PGM シーケンサー (Life Technologies)によってターゲットシーケンシングを行い、DNA変異の網羅的解析を全プラークについて施行する予定であった。現状で全エクソーム解析を行い、統計、生物情報分析softwareを使用し、variant calling, filteringを行い、高石灰化プラーク群と低石灰化プラーク群との差異の検出を行った段階で、おおむね順調に経過しているので、今年度以降、さらに安定・不安定粥腫を比較し特有なDNA変異を明らかにする。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成31年度は、エピジェネティクス解析として、DNAメチル化領域の濃縮を行い、高石灰化粥腫群と低石灰化粥腫群でのDNAメチル化状態の差異を明らかにすることを計画している。EpiXplore Methylated DNA Enrichment Kit (Takara) を用い、頚動脈内膜剥離術で摘出した頚動脈粥腫からゲノムDNAを抽出し(NucleoSpin Tissue, MNA)、超音波破砕器を用いて断片化し、磁性ビーズ（TALON）に結合させたMBD2とメチル化DNAを結合させた後、高濃度の塩で溶出させ、濃縮産物を、qRT-PCR, microarray, NGSを用いて分析する予定である。実験の進捗具合によりその後さらなるエピジェネティクス解析として、修飾ヒストン抗体でクロマチン免疫沈降を行い、高・低石灰化粥腫群でのヒストン修飾の差異を明らかにする計画である。頚動脈内膜剥離術で摘出した頚動脈粥腫をホルムアルデヒドでクロスリンクし、超音波破砕によりクロマチンを断片化した後、抗体とMagnosphere磁気ビーズを添加して免疫沈降(ChIP: chromatin immunoprecipitation)を行い、Input画分としてDNAを抽出、回収、精製してコントロールとし、免疫沈降物をqRT-PCR, microarray, NGSで解析する予定である。
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| Causes of Carryover |
平成３０年度助成金不足分を、概算にて前倒し支払いを申請したところ、実際の支払い金額と約4%の誤差が生じたもの。残額は平成３１年度助成金と合わせ研究遂行のため有効利用する。
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