2021 Fiscal Year Research-status Report
石灰化スコア分類に基づく頚動脈粥腫安定化機構解明のためのオミックス解析の展開
| Project/Area Number |
18K08977
|
|---|
| Research Institution | Nagoya City University |
|---|
Principal Investigator |
片野 広之 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 准教授 (30295612)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | 頚動脈狭窄症 / 頚動脈プラーク / 石灰化プラーク / ゲノム |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
平成30年度に高石灰化頚動脈粥腫において、血管新生および石灰化に関与する遺伝子の一塩基多型の差異を明らかにした。これを踏まえて、さらに高石灰化頚動 脈粥腫の遺伝子修飾の特徴を探るため、令和元年度および2,3年度は、頚動脈内膜剥離術にて摘出した8粥腫についてカルシウムスコアをもとに高・低石灰化2群 (3:5)に分け、 ゲノムDNAを抽出後、Bisulfate変換し、増幅、断片化、精製し再懸濁後、Infinium MethylationEPIC BeadChipアレイにapplyしhybridizationを 行った。標的ヌクレオチドを取り込ませ蛍光色素標識抗体を用いて染色後、Illumina iScanを用いて蛍光イメージを取得し、GenomeStudio/Methylation Module を用いてデータマイニング解析を行った。RefSeqアノテーション情報を用い、全プローブ、プロモータ領域、CpG Island領域について、高・低石灰化群間でDNA メチル化頻度が有意差を示すデータを抽出した。プローブをBMIQで正規化し、p<0.05でフィルタリングを行いプローブを抽出した。プロモータ領域 にてメチル化異常を示した667遺伝子のうち、低メチル化が94.5%を占めた。主成分分析で高石灰化群は低石灰化群と分画され、高石灰化群において13遺伝子で|log2 ratio|>1.0 のメチル化差異を認めた。promoter領域で検出された遺伝子と、各ゲノム領域ごとに検出された遺伝子を比較すると、CGRP受容体として血管拡張、平滑筋細胞増殖抑制などに関与し、抗動脈硬化作用および石灰化作用のあるRAMP1の低メチル化が、promoterと組織特異的なCpG island shore領域で共通して抽出された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度に頚動脈内膜剥離術にて摘出した10粥腫についてカルシウムスコアをもとに高・低石灰化2群に分け、それぞれ核酸を抽出後、SureSelect XT Human All Exon (Agilent)を用いエクソンを濃縮してシーケンスライブラリーを作成、次世代シーケンサーHiSeq2500(Illumina)を用いて塩基配列を取得した。Quality Score 30以上の塩基は91.8-94.5%と良好であった。BMA-MEMによりhg19へマッピング(99.6-99.7%)し、PicardによりDuplicateリードを除去した(ユニーク率 95.6-96.5%)。平均カバー率(>10x)は97.6%であった。頚動脈粥腫について、高石灰化群と低石灰化群の全エクソームシーケンスによりゲノム変異の特徴を比較 検討した。高石灰化粥腫において、血管新生および石灰化に関与する遺伝子の一塩基多型の差異を認めた。令和元年度および2年度はゲノムDNAを抽出後、 Bisulfate変換し、 増幅、断片化、精製し再懸濁後、Infinium MethylationEPIC BeadChipアレイにapplyしhybridizationを行った。標的ヌクレオチドを取り込 ませ蛍光色素標識抗体を用いて染色後、Illumina iScanを用いて蛍光イメージを取得し、GenomeStudio/Methylation Moduleを用いてデータマイニング解析を 行った。RefSeqアノテーション情報を用い、全プローブ、プロモータ領域、CpG Island領域について、高・低石灰化群間でDNAメチル化頻度が有意差を示すデータを抽出した。石灰化に関する遺伝子のエピジェネティクスとして、メチル化状態の差異を認めた。以上の如く概ね順調に研究が進展している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度は、残りの予算を用いて、英語論文作成を追加し、国際学会での発表にて本研究の総括を行う予定である。
|
| Causes of Carryover |
令和3年の国内学会および国際学会発表に伴う経費等への使用を予定していたが新型コロナウイルス感染症による影響で学会がWeb開催になり、当該経費に関わる 使用の一部を令和4年度に持ち越す必要が生じたため。
|
