2018 Fiscal Year Research-status Report
Investigation of spatiotemporal characteristics of oxidative stress and neuroinflammation in mild traumatic brain injury
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18K08986
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| Research Institution | National Defense Medical College |
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Principal Investigator |
川内 聡子 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 防衛医学研究センター 生体情報・治療システム研究部門, 講師 (20506505)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 俊一 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 防衛医学研究センター 生体情報・治療システム研究部門, 教授 (90502906)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 軽症頭部外傷 / 衝撃波 / 酸化ストレス / 血液脳関門 / 神経炎症 / 一酸化窒素 / 免疫組織化学染色 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，衝撃波に由来するラット頭部外傷モデルを対象に，その病態と機序を明らかにするため，①酸化ストレス，②血液脳関門の破綻，③アストロサイト，ミクログリアの活性化，④神経炎症の各標識マーカーを用いた免疫組織化学染色を行い，各事象の脳内分布と発生の時間スケールを明らかにすることを目的とする。初年度（平成30年度）は，下記の項目について検討を行った。
・免疫組織化学染色による病理カスケードの時空間特性の解析：超急性期の酸化ストレスに関する検討
衝撃波は細胞内カルシウム濃度を上昇させ，これにより一酸化窒素合成酵素（NOS）が活性化し，一酸化窒素（NO）が大量に産生すると予想される。加えてSDが発生すると，神経細胞内のカルシウム濃度上昇によりさらなるNO産生とスーパーオキシドアニオン（O2-）の産生が促進されうる。NOはO2-と容易に反応し，毒性の強いパーオキシナイトライト（ONOO-）を生成し，血管や細胞を障害する可能性がある。このことから，初年度は衝撃波適用後超急性期の脳について，酸化ストレスマーカーである3-Nitrotyrosine（3NT）と，その発現部位を調べるため神経細胞マーカーNeuNまたは血管内皮細胞マーカー（RECA1）を用いて免疫組織化学染色を行った。LISW適用後2 hにラット脳をかん流固定，摘出し，LISW適用部近傍位置の脳切片について免疫染色を行った。その結果，衝撃波を適用した脳の大脳皮質において3NT陽性細胞が観測され，3NTは主として神経細胞と，一部の血管内皮細胞に分布することが分かった。この結果は，上述した仮説と矛盾しないものと推察された。次年度は，同酸化ストレスの時間変化について調べるとともに，血液脳関門の破綻，アストロサイト，ミクログリアの活性化，神経炎症，との関係について検討を進める計画である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ラット脳の免疫組織化学染色を行うにあたり，当初パラフィン包埋切片を用いていたが，安定した染色結果が得られなかったため凍結切片に変更し目的とする結果を得ることができた。ウェスタンブロット，ELISA等他の免疫化学的手法の準備も同時に進めたが，最終的には凍結切片にて染色条件，プロトコルを概ね最適化でき，酸化ストレスに関して一定の結果を得ることができたことから，研究はおおむね順調に進展しているものと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
軽傷頭部外傷の病理カスケードの時空間特性の解析を確実に進めるため，まずは外傷後，2 h, 24 h, 7 days, 30 days, のサンプルを作成し，複数のマーカーを用いて免疫組織化学染色を進める。免疫組織化学染色に関しては，当研究室で行うだけでなく，染色技術を有する共同研究先と連携を強め，効率的に進める計画である。
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| Causes of Carryover |
当該残額は，免疫組織化学染色用の抗体（約7万円）に使用したいため，翌年度に使用する計画である。
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