Establishment of a novel therapy for hemiplegia through repair pathways of Reelin/Disabled/GSK3.

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09009
• Research Institution: St. Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 高井 憲治 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (60121167)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 登 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (40235982)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 大脳皮質運動野損傷 / 片麻痺 / 細胞移植治療 / ニューロスフェア / Reelin / Disabled1 / yotariマウス

Outline of Annual Research Achievements

大脳皮質運動野損傷の実験的片麻痺モデルマウスの治療に、ニューロン前駆細胞を損傷部に移植して運動機能を回復させる実験を行って来た。ニューロン前駆細胞としてはヒトiPS由来の細胞などが用いられ、損傷部下部の線状体に移植した。
この運動機能の回復メカニズムを探るため、大脳皮質の発生に重要な役割を果たしていることが知られているReelinに着目し、その成体マウスでの機能を確認した。Reelinの細胞内アダプタータンパク質であるDab1がその遺伝子に欠失等があるために機能不全となったyotariマウス(yot/yot)を用い、これから得たニューロスフェアの細胞を移植した場合と、正常マウスのニューロスフェアの細胞を移植した場合を比較し、Reelin経路の作用を確かめた。Reelinは大脳皮質発生時、その層構造(第2層から第6層)を構築する上で重要な分子であることが分かっており、yot/yotマウスでは層構造が乱れる。yot/yotマウス由来ニューロスフェアの細胞移植を行った場合、移植細胞はReelinシグナル経路を進めることができない。このことが移植細胞の皮質損傷部への移動を妨げ、損傷部の機能回復をなし得なかったと考えられる。マウス新生児脳障害後の新生ニューロンの移動に放射状グリア細胞が足場として機能したという研究結果(Kaminou & Sawamoto 2018)がある。本研究の結果として、正常マウスの脳損傷後の損傷部に放射状グリア細胞のマーカーであるGfapが高密度に見出されたことは矛盾しない。加えて損傷部の移植細胞にはSynapsin1(シナプスマーカー)、Nfm(ニューロンマーカー)の発現が認められ、移植神経細胞が脳損傷部において損傷ニューロン代替の機能を果たしていることが確かめられた。この過程において重要な因子はReelinおよびそのシグナル伝達経路であることが確認された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

大脳皮質運動野損傷の実験的片麻痺モデルマウスに対する治療法としてニューロン前駆細胞の、損傷部への移植により運動機能を回復させる実験を行った。ニューロン前駆細胞を、これまで、ヒトiPS由来のものを用いて実験を行って来た。
この運動機能の回復メカニズムを探るため、大脳皮質の発生に重要な役割を果たしていることが知られているReelinに着目し、その成体マウスでの機能を確認した。Reelinの細胞内アダプタータンパク質であるDab1がその遺伝子に欠失等があるために機能不全となったyot/yotマウスを用い、これから得たニューロスフェアの細胞を移植した場合と、正常マウスのニューロスフェアの細胞を移植した場合を比較し、Reelin経路の作用を確かめた。
正常マウスのニューロスフェアの細胞を移植したマウスの損傷部の移植細胞にはApoer、Vldlr(両者ともReelinレセプター)、pDab1のほか、Integrin α5、β1、Ncadherin(接着因子)の発現が認められ、Reelin経路が動いたことが確認できたが、yot/yot由来のニューロスフェアの細胞を移植した場合は、移植細胞は線状体移植部位に留まっていた。
また、ニューロスフェア由来の細胞のin vitroでの各種分子の発現を、Reelin、Reelin関連分子(Apoer、Vldlr、Dab1、pDab1)、運動ニューロン関連分子(Nestin、Nfm、Foxp2、Fezf2、Crim1)、Reelin関連接着分子(Integrinα5、β1、active Integrinβ1、Ncadherin)で見たところ、yot/yot由来のニューロスフェアの細胞ではpDab1、active Integrinβ1の発現が全く見られないという矛盾しない結果が得られた。

Strategy for Future Research Activity

yot/yotマウスのニューロスフェア由来の細胞にDab1遺伝子をtransfectし、その組換え細胞におけるリン酸化Dab1の発現、Integrinβ1活性型の発現、さらにはニューロンマーカー(Ctip2など)が発現するかどうかを確認する。transfected細胞におけるReelin経路の回復を見る。
成体での発現に乏しいReelinは損傷で発現が上昇、移植により強く発現誘導された。Reelinは細胞接着因子Integrinを活性化し細胞外基質との接着を亢進により神経細胞配置を制御する。運動神経とその神経サーキットに対してもReelinの脳室持続投与が正の作用を示す可能性は高く、片麻痺モデルへの治療に応用できる可能性がある。そこでReelin、SDF1が関わるシグナル伝達経路に関与するBDNFやSema3Aなど他のシグナルについての脳損傷時の相互作用を調べるために、損傷脳及び移植後脳でのこれらの分泌性因子の発現推移を免疫組織染色を中心に調べる。
皮質運動野の再生過程における神経幹細胞遊走関連分子と多層化誘導分子を解析するため大脳皮質6層形成に重要な遺伝子発現を観察する。神経幹細胞の放射状移動に関与するReelin, Dab1, cdk-5, p35等に加え、大脳皮質発生関与の分子として、Filamin-A、FILIP、Doublecortin、PAF-AHβ、LS1、Fukutin等の遺伝子・蛋白発現とそれらへの上記薬剤の影響を検討する。成長因子や他のケモカインを併用しての多層化、皮質構造の再構築が得られない場合には持続注入や分泌細胞を作成し、皮質構造の再構築を試みる。マウス個体へのReelinや上記阻害、促進薬剤投与、あるいは関連遺伝子変異マウスから作製したニューロスフィアを用いた移植による移植神経細胞の移動時の形態変化がどのように変わるかについて解析する。

Causes of Carryover

(理由) 輸入試薬の納品が遅れたことがあったため。
(使用計画) その後遅れは解消したが、支払については年度内決算が繰越となって解消の予定である。