2019 Fiscal Year Research-status Report
Establishment of a novel therapy for hemiplegia through repair pathways of Reelin/Disabled/GSK3.
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18K09009
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| Research Institution | St. Marianna University School of Medicine |
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Principal Investigator |
高井 憲治 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (60121167)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 登 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (40235982)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細胞移植治療 / ヒトiPS由来神経前駆細胞 / 片麻痺モデルマウス / Reelin / yotariマウス / Disabled1 / 1次運動神経 / 神経再生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
大脳皮質運動野(後肢領域)損傷の実験的片麻痺モデルマウスに対する治療法として、ヒトiPSから、神経前駆細胞（NSPCs: neural stem/progenitor cells）を、胚様体形成から神経系誘導因子の作用を経て作成し、損傷部下部の線状体に移植したところ、後肢運動機能が回復した。
この回復メカニズムを探るため、大脳皮質の発生に重要な役割を果たしていることが知られているReelinに着目し、成体マウスでの機能を確認した。Reelinの細胞内アダプタータンパク質であるDab1がその遺伝子に欠失等があるために機能不全となったyotariマウス(yot/yot)を用い、これから得たニューロスフェアの細胞を移植した場合と、正常マウスのニューロスフェアの細胞を移植した場合を比較した。Reelinは大脳皮質発生時、層構造(第2層から第6層)構築上重要な分子であり、yot/yotマウスでは層構造が乱れる。yot/yotマウス由来ニューロスフェアの細胞移植では、移植細胞は皮質損傷部への移動を妨げられ、損傷部は機能回復できない。正常マウスのニューロスフェアの細胞の移植では、移植細胞は皮質損傷部への移動し、運動機能は回復した。この原因はReelinシグナル経路の有無にある。次にyot/yotマウスのニューロスフェア細胞にDab1遺伝子を導入し、細胞分化に従って正常細胞と並行的に運動神経マーカーの発現が見られることを確認し、Dab1は神経分化上代替経路のない必須経路の分子であることが確認できた。加えて損傷部の移植細胞にはSynapsin1(シナプスマーカー)、Nfm(ニューロンマーカー)が発現し、移植細胞が脳損傷部において損傷ニューロン代替の機能を果たしていた。この過程において重要な因子はReelinおよびそのシグナル伝達経路であることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
大脳皮質運動野(後肢領域)損傷の実験的片麻痺モデルマウスに対する治療法として、ヒトiPSから神経前駆細胞（NSPCs）を作成し損傷部下部の線状体に移植したところ、後肢運動機能が回復した。
この回復メカニズムを探るため、大脳皮質の発生に重要な役割を果たしているReelinに着目し、その成体マウスでの機能を確認した。Reelinの細胞内アダプタータンパク質であるDab1がその遺伝子に欠失等があるために機能不全となったyot/yotマウスを用い、これから得たニューロスフェアの細胞を移植した場合と、正常マウスのニューロスフェアの細胞を移植した場合を比較し、Reelin経路の作用を確かめた。
正常マウスのニューロスフェアの細胞を移植したマウスの損傷部の移植細胞にはApoer、Vldlr(両者ともReelinレセプター)、pDab1のほか、Integrin α5、β1、Ncadherin(接着因子)の発現が認められ、Reelin経路が動いたことが確認できたが、yot/yot由来のニューロスフェアの細胞を移植した場合は、移植細胞は線状体移植部位に留まっていた。
また、ニューロスフェア由来細胞のin vitroでの各種分子の発現を、Reelin、Reelin関連分子(Apoer、Vldlr、Dab1、pDab1)、運動ニューロン関連分子(Nestin、Nfm、Ctip2、他)、Reelin関連接着分子(active Integrinβ1、Ncadherin、他)で見たところ、yot/yot由来の細胞ではpDab1、active Integrinβ1の発現が全く見られなかった。
次にyot/yotマウスのニューロスフェア細胞にDab1遺伝子を導入したところ、正常細胞に並行した運動神経マーカーの発現が観察できた。神経分化におけるDab1の関与は代替経路のない必須なものであることが確認できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
yot/yotマウスのニューロスフェアの細胞の移植では、Reelinが移植細胞のレセプターApoer2やVldlrに作用しても、Dab1へのシグナルがストップし、続くGSK3(神経細胞細胞骨格、樹状突起形成、細胞移動などの作用)、また、Rap1を介したNcadherinおよびIntegrinα5β1へシグナルが伝わらず細胞移動が行われなかった。すでにpDab1、ApoER2、EphrinB2がシナプスで複合体を形成することが報告されている。yot/yotマウスのニューロスフェア由来の細胞にDab1遺伝子を導入した組換え細胞の細胞分化において、さらにシナプス前構造およびシナプス後構造の分化が行われるかどうか、さらにそれらがシナプス形成を行うかどうかを、シナプス形成に重要な役割を果たしているレセプター・リガンドであるEphrin-Ephレセプターの発現を調べて確認する。
in vivoにおけるEphrin-EphR発現は脳損傷マウスにおける正常ニューロスフェア細胞の移植後に期待できるがyot/yotマウスNSPCs細胞の移植後の損傷部位では期待できないであろう。
成体ではほとんど発現が見られないReelinは細胞接着因子integrinを活性化、細胞外基質との接着亢進によって神経細胞配置を制御する。運動神経とその回路に対してもReelinの脳室持続投与が正作用を示すので、片麻痺モデル治療に応用できる。Reelin、SDF1シグナル伝達経路に関与するBDNFやSema3Aなどのシグナルについての脳損傷時の相互作用を調べる。
同定因子の発現制御による活性化機構を調べる。皮質運動野再生過程における神経幹細胞遊走関連分子と多層化誘導分子解析のため大脳皮質6層形成に関与する遺伝子発現を観察する。マウス個体へのReelinや上記阻害、促進薬剤投与による移植神経細胞の移動時の変化を調べる。
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| Causes of Carryover |
物品費として支出予定。コロナ感染症問題に起因する生産物流障害による先送りのため。
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