2019 Fiscal Year Research-status Report

The investigation of the micro RNAs to contribute cartilage repair.

Research Project

Project/Area Number	18K09021
Research Institution	Niigata University
Principal Investigator	目良恒新潟大学, 医歯学総合病院, 特任講師 (70650381)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	望月友晴新潟大学, 医歯学総合病院, 助教 (00773607) 谷藤理新潟大学, 医歯学総合病院, 助教 (30748348) 石橋宰大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (70293214)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	幹細胞 / 脂肪由来幹細胞 / 軟骨修復・再生 / 組織修復・再生 / マイクロRNA / エクソソーム
Outline of Annual Research Achievements	変形性膝関節症に対して、現在、保険外診療で自家脂肪由来細胞(ADSC)移植治療が普及しつつある。本治療は間葉系幹細胞（MSC）であるADSCが関節の恒常性維持に主要な役割を果たしていると考えられるが、その作用機序については明らかになっていない。申請者は、その作用機序解明を目的に、本研究でドナー間や培養条件の違いで生じるADSCおよび細胞由来の分泌小胞体であるエクソソームの解析を行っている。申請者がこれまで行った実験と同様に、ADSCでもbFGF添加による細胞の形態的変化が観察され、さらに増殖促進作用についても過去の実験とほぼ同等の結果を得た。さらに軟骨分化誘導実験を行い、軟骨特異的遺伝子の発現量をqRT-PCRで定量化し、増殖期におけるbFGF添加による未分化能維持について確認した。また、分化誘導前の培養上清から超遠心機を用いてエクソソーム回収を試み、qNanoによる粒度分布（粒子径・粒子数）解析にてこれらの粒径が約100nmであることを確認した。さらに、このエクソームについて、miRNA-Seqを用いてFGF添加の有無による分泌エクソーム中のmiRNA量の比較を行い、いくつかのmiRNAについては複数のドナーにて同様の変動を示すことを確認した。今後これらの変動miRNAについて、残存RNAサンプルを用いてqRT-PCRによるvalidationを行う。さらに別ドナーで一連の実験を繰り返し行い、再現性を確認する。また変動miRNAについてin silicoで標的遺伝子を予測し、それらの発現変動を調べる。予想通り変動していれば、レポーターアッセイでの確認、遺伝子ノックダウンによる機能解析についても計画する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 昨年の軌道修正から、現状ではエクソソーム解析が行われ、さらにmiRNA-Seqによる実験結果も得られ、FGF添加の有無による分泌エクソーム中のmiRNA量の比較を行い、いくつかのmiRNAはドナー間でも同様の変動結果となることを確認した。ｑRT-PCRによるvalidationや再現性の検討については、当初計画では年度内に行うことを目指したが、完結することはできなかった。しかし年度明けにはすぐに実験を始めて間もなく完了する予定であり、大きな影響はない。したがって進捗は概ね計画通りと判断している。
Strategy for Future Research Activity	上述の通り、またドナー変更の上、細胞増殖期の分泌エクソソーム内および細胞内の注目するmiRNAについてqRT-PCRで定量解析する。その際その後の軟骨分化能実験行う。軟骨分化誘導の実験系はペレットカルチャーでは必要とする細胞数が多く限界があるため、マイクロマスカルチャーに変更する。軟骨分化能の定量化についてはアルシアンブルー染色およびOD595nmでの比色定量を行うことを検討している。分子生物学的解析にはSox9、2型コラーゲン、アグリカンなどの軟骨特異的遺伝子の発現量をqRT-PCRにて定量化している。これら一連の実験を繰り返し行い、再現性を検討する。これら実験の再現性が得られれば、変動したmiRNAについてin silicoで標的遺伝子を予測し、それらの発現変動を調べる。解析には、Targetscan/microT-cDsやmirTarBase/TarBaseなどの公開されたデータベースを用い、標的遺伝子の絞り込みを行うことを検討している。予想通り変動していれば、レポーターアッセイでの確認、遺伝子ノックダウンによる機能解析についても計画する。
Causes of Carryover	初年度の研究体制の構築および環境整備に時間を要し、実験の着手が遅れたため使用金額に差が生じた。今年度実験を進めたが、初年度の遅れを埋め合わせるに至らなかった。実験系はほぼ確立しており、予定通り遺伝子解析などの実験を遂行できれば、計画していた予算を本年度で使用する計画である。