2018 Fiscal Year Research-status Report
Tm mapping法を用いた骨関節軟部組織感染症の原因菌種迅速同定法の確立
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18K09043
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
内山 勝文 北里大学, 医学部, 准教授 (90286310)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 人工関節周囲感染 / 感染 / PCR / Tm mapping / 16S-rRNA / 関節液 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまで、PCRラテラルフロー法を用いた人工関節周囲感染（PJI）における早期診断の可能性につき検討した。その結果、femA、mecA の組み合わせからMRSA、MSSA、MR-CNSの感度の高い検出が可能となった。しかしこの検査では femA、mecAの両者が陰性の場合、その他の菌が存在していても（偽）陰性になってしまうという欠点があった。そこで仁井見らが開発した真核生物である酵母をホストとしてbacterial DNA contamination-freeを世界で初めて実現したTaq DNA polymeraseを用いて、16S-rRNA遺伝子の8か所のconserved regionに、7つのbacterial universal primerをセットして設計し、得られる7つのampliconのTm値の組合せによる二次元 mappingを菌のフィンガープリントとする新たな敗血症の原因菌迅速同定システムであるTm mapping法をPJIの迅速診断に導入した。サンプル間誤差はTm mapping shapeそのものに影響するため、Tm mapping 法を用いて同定するためには、サンプル間誤差を出来るだけ小さくすることが重要となる。同システムを用いてPJIを疑った関節液を検査したところ、細菌培養検査で検出可能であった菌種の同定はほぼ可能であった。しかし真菌感染の場合は、プライマーが異なるため診断は不可能であった。また非感染例では細菌培養検査が陰性だったが、Tm mapping法では菌種が同定された検体もあった。1例は術後の死菌を検出した可能性が高く、もう1例は2菌種以上の混合感染の可能性が示唆された。以上より臨床経過と合わせた最終診断が必要であり、今後PJIおよびPJI以外の症例も増やして検討する必要があると考える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Tm mapping 法により、人工関節周囲感染での不特定の原因微生物の同定を種属レベルで行うことが可能であると考える。原因菌が複数菌の場合は、同定困難が予想されるため、次世代シーケンスを用いての評価も数例であるが行った。しかし臨床的な意義については症例を重ねる必要がある。いまのところ7つのbacterial universal primer (全てのバクテリアDNAを検出するprimer)のみの使用であり、fungal universal primerを用いておらず、真菌の同定が困難であったので、primerの追加が必要と考える。mecA primerはRT-PCRを用いて検出することでMRSAの診断は可能であった。今後さらに症例数を増やしての検討が必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
真菌に対応するfungal universal primerの追加。血液培養検査と比較するとPJIの関節液は菌数が多いため、1st PCRによる菌数の定量的評価による菌種同定の信頼度の評価。関節液以外の組織を用いた検査の信頼性の検討。複数菌感染の診断方法の確立と次世代シーケンサーを用いた確認が必要と考える。
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| Causes of Carryover |
PCR手技を行うためにDNAキット、プライマー等が必要である。次世代シーケンサーでの確認が必要な検体もあり、高額な検査であることから経費が必要である。今年度は国際学会への参加、発表の予定もあり、バランス良く経費を使用する必要がある。当該年度は約5万円の差引額があるが、年度末での無理な支出を抑えた。
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