2019 Fiscal Year Research-status Report
Tm mapping法を用いた骨関節軟部組織感染症の原因菌種迅速同定法の確立
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18K09043
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
内山 勝文 北里大学, 医学部, 准教授 (90286310)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 人工関節周囲感染 / 感染 / PCR / Tm mapping 法 / 16S-rRNA / 関節液 / 骨関節軟部組織感染症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではTm mapping法を骨関節軟部組織感染症の迅速診断に導入して行っている。人工関節周囲感染症や骨関節軟部組織感染症を生じた関節液は血液培養検査と比較すると菌数が多いため、1st PCRによる菌数の定量的評価による菌種同定の信頼度の評価が必要である。
今年度は既にnegative controlを含めた関節液を採取し、骨関節軟部組織感染症の原因菌の迅速同定・定量検査を実施した。Tm mapping法による定量法として、関節液中の細菌量を1st PCRを用いて測定した。相対的定量試験にATCC株のStaphylococcus aureus、Streptococcus agalactiae 及び Escherichia coliを血液寒天培地にて18時間培養し、無菌的生理食塩液でMcFarland 0.5（1-2ｘ10の８乗 Colony-forming unit：CFU/ml）に調整して用いた。CFUによる菌数は信頼性が低いため、フローサイトメーター Navios（coluter）によりBacteria Counting Kitを用いて細菌のDNAを染色し、3菌種の菌数を算出し検量用試料に使用した。対照法として検量用ポジテイブコントロール（三井化学）を用いて2nd PCRと比較検討した（第一世代Tm法）。Tm mapping法定量検査における原因菌の判定として、Golden standardである細菌培養・同定検査と、Tm mapping法定量検査を比較し、原因菌の判定のカットオフ値の設定について検討した。臨床的に人工関節周囲感染症と診断され、培養・同定検査が陽性20例、及び陰性20例を用いてROC曲線を作成し、Tm mapping 法定量値をカットオフ値(100)に設定した（第二世代Tm法）。今後さら検体数を増やし、この定量検査の感度特異度についての検討が必要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
臨床的に感染症と診断され、培養・同定検査が陽性20例、及び陰性20例を用いてROC曲線を作成しTm法定量値をカットオフ値に設定することができ、おおむね順調に研究は進展していると考えている。しかし、さらにカットオフ値の精度を向上させるために検体数を増やす必要がある。Tm mapping法により、人工関節周囲感染症での不特定の原因微生物の同定を種属レベルで行うことがおおむね可能になったと考えているが、原因菌が複数菌の場合は同定が困難なため、引き続き次世代シーケンスを用いての評価、検証を行う必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
人工関節周囲感染症疑い、骨関節軟部組織感染症疑いの関節液、組織検体での原因菌迅速同定・定量検査の症例数を増やし評価する。第一世代Tm法と第二世代Tm法における関節液の定量性についてさらに比較する。Tm法定量検査における臨床での感染の有無による原因菌の判定を行う。今後、臨床経過と人工関節周囲感染症の診断基準に基づいた感染の有無から、定量した菌数のカットオフ値をさらに検討する。起炎菌同定の迅速性が人工関節周囲感染症・骨関節軟部組織感染症の治療にどれ程役立ったかの評価を行う。「菌数」を指標とした検査が人工関節周囲感染症・骨関節軟部組織感染症の治療経過の効果判定にどれ程役立つのかの評価を行う。
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| Causes of Carryover |
前年度に購入したPCR手技を行うためにDNAキット、プライマー等の試薬が残っており、本年度の研究に使用した。複数菌が原因の場合、次世代シーケンサーでの確認が必要な検体もあり、次世代シーケンサーは高額な検査であることから次年度に経費が必要である。次年度が最終年度であるため、試薬の購入、論文作成費用などに経費を使用する予定である。次年度使用額が生じたが、年度末での無理な支出を抑えた。
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[Presentation] 人工関節周囲感染の診断－バイオマーカーとPCR－2019
Author(s)
内山勝文,櫻井慶造,仁井見英樹,神田宏美,峯岸洋次郎,池田信介,福島健介,森谷光俊,狩野有作,高平尚伸,髙相晶士
Organizer
第34回日本整形外科学会基礎学術集会
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[Presentation] 人工関節周囲感染における迅速診断の試み－PCR法とα-Defensin－2019
Author(s)
内山勝文,櫻井慶造,仁井見英樹,神田宏美,峯岸洋次郎,池田信介,福島健介,高平尚伸,高相晶士,高山陽子,和田達彦,中村正樹,花木秀明髙相晶士
Organizer
第93回日本感染症学会総会・学術講演会
