2019 Fiscal Year Research-status Report

Roles of Bone Morphogenetic Protein 2 in postnatal meniscus homeostasis

Research Project

Project/Area Number	18K09056
Research Institution	Tokyo Medical and Dental University
Principal Investigator	古賀英之東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 准教授 (30594080)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	辻邦和東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座准教授 (20323694) 関矢一郎東京医科歯科大学, 統合研究機構, 教授 (10345291) 宗田大東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 非常勤講師 (50190864)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	半月板 / BMP2 / BMP4 / BMP7 / 円板状半月板
Outline of Annual Research Achievements	半月板は関節機能の維持に必須の組織であるにも関わらず、その発生並びに恒常性の分子機序はほとんど解析されていない。私たちのこれまでの研究から、骨形成因子(BMP, Bone Morphogenetic Protein)ファミリーに属する分子BMP2を半月板形成期に欠失させると半月板形成に異常をきたすことを明らかとしている(Tsuji et al, Nature Genetics, 2006)。そこで本研究では、半月板におけるBMP2の情報伝達経路を詳細に解析し、その形態形成、成熟、恒常性及び損傷後修復のプロセスにおける分子機能を明らかとすることを目的としている。私たちは、発生過程における関節形成初期に、四肢の間葉組織特異的に骨形成因子BMP2を欠損させる(Bmp2c/c;Prx1::cre)と、100%の確率でヒトの円板状半月板に類似した形態異常が観察されることを示した。本研究において、Bmp2c/c;Prx1::creマウスにおける半月板組織の形成過程を組織学的に観察したところ、軟骨分化（成熟）のプロセスがほぼ完全に阻害されることを発見した。すなわち、これら欠損マウスでは胎生17日前後に半月板の予定領域に細胞の集積が観察されるが、それらは軟骨細胞への分化が観察されず、細胞外基質へのプロテオグリカンの蓄積も観察されなかった。一方で発生過程における関節形成初期に、四肢の間葉組織特異的に骨形成因子BMP4またはBMP7を欠損させたマウス(Bmp4c/c;Prx1::cre, Bmp7c/c;Prx1::cre)では、半月板の形成に異常は観察されなかった。以上の結果は、半月板形成過程においてBMP2が必須かつ特異的な生理機能を有すること、形態的にはヒトの円板状半月と類似しているが、ヒトの病態とは異なることを示唆している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度、半月板形成過程におけるBMP関連分子の時空間特異的発現を検討することを予定していたが、未だ実験条件の検討段階である。一方で、BMPファミリーに属する他の分子(BMP4および7)の表現系解析を行ったことで大きな進捗はあったことから、全体的に見てプロジェクトの進捗は得られていると考えている。
Strategy for Future Research Activity	本年度は主に以下の２点に関して、継続して検討を行う。（１）半月板形成過程におけるBMP2及びその受容体分子(Alk3, Alk6, BmpRII, ActRIIa, ActRIIb)の時空間的発現解析。BMP2欠損マウスにおいて観察された半月板の形態異常の機序を解析するにあたって、半月板形成過程においてどの時期にどの場所でBMP2及びその受容体が発現しており、どの細胞がシグナルを受け取っているかを同定することは非常に重要である。この考えから、野生型マウスの膝関節を用いて、胎生15.5, 16.5, 18.5, 生後0, 1, 2, 3, 4週の半月板領域におけるこれらリガンド、受容体分子の発現をIn Situ Hybridization法を用いて解析を行う。また、BMP2シグナルを受け取っている細胞の同定はSmad1分子のリン酸化抗体を用いた免疫組織染色法を用いる。（２）半月板形成（成熟）過程においてBMP2により制御される標的遺伝子の同定。BMP2による半月板形成の分子機序を解析するため、胎生15.5, 16.5, 18.5, 生後0, 1, 2, 3, 4週の野生型及びBMP2欠損マウスの半月板からLaser Capture Microdissection法を用いて組織を回収し、そこからRNAの採取を行う。Microarray法を用いて、野生型とBMP2マウスの間で発現量の異なる遺伝子の同定を行う。さらにその中から重要と思われる遺伝子のピックアップを行い、項目1と同様の実験を行なって、半月板の形成過程における遺伝子発現のカスケードの解析を行う。
Causes of Carryover	年度後半において、トランスジェニックマウスのコロニーの拡大に時間がかかり、動物実験に関わる費用の計上が予定より少額となった。次年度使用計画に取り入れる予定である。年度後半において遺伝子発現解析の実験条件の決定に時間がかかり、予定額を下回った。次年度使用計画に取り入れる予定である。