ゲノムワイドエンハンサー解析を用いたTWIST1の変形性関節症寄与メカニズム解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09065
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 長谷井 嬢 岡山大学, 医学部, 客員研究員 (40636213)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 寺村 岳士 近畿大学, 大学病院, 講師 (40460901) ; 村川 泰裕 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, チームリーダー (50765469)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: TWIST1 / エンハンサー / ゲノムワイド

Outline of Annual Research Achievements

不死化ヒト軟骨細胞株(TC28)においてTWIST1を強制発現させ、LC-MSでTWIST1と結合するタンパク質を網羅的に測定した。また、TC28にAd-TWIST1-IRES-GFPを用いてTWIST1を高発現させたのち、FACS ariaでGFP発現のある細胞だけをソートし、TWIST1高発現細胞株を集めてRNA抽出を行った。このサンプルを分担施設である理研-HMC臨床オミックス特別ユニットへ送付し、共同研究の形で、CAGE法によりゲノムワイドにエンハンサー領域の検出を行った。この結果は既にデータとして受け取っており、現在は近畿大学と共同でCAGEデータの解析と、インフォマティクス解析によりTWIST1関連エンハンサー領域候補の解析を行っている。また並行して、TC28にMycタグを付加したTWIST1を強制発現したサンプルを用いて、Myc抗体でクロマチンIPを行い、バリデーション作業を行っている。また、確認の為には、２つのguideRNAを用いてCRISPR-deletionにより特異的にエンハンサーの除去を行い、転写に変化が起きるか観察する事が必要である。エンハンサーを抜き取る形でゲノム編集する必要があり、きれいに抜けた細胞のみを選択し解析する工程に多くの時間を要している。現在も実験を継続中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

CAGE法によるゲノムワイド解析は終了しているが、TWIST1が作用する領域は多く、エンハンサーとして作用する領域の特定に時間を要している。特にCRISPRによるKO細胞についてはKO効率や、非KO細胞の排除など、工程に時間を要する部分も多く実験は遅れている。またCOVID-19の影響により、共同研究先の近畿大学では、緊急事態宣言など、実験遂行にあたって制限がでた事も多く、要因の一つとなっている。

Strategy for Future Research Activity

網羅的なエンハンサー解析にはその候補領域の多さから、期間に完了するには問題があり、特定領域のみに絞って解析するなどの方針の転換が必要である。

Causes of Carryover

COVID-19による影響で実験速度に大きな遅延が生じている。ターゲット部位の絞り込み後、該当領域のゲノム編集を継続して行う予定であり、必要物品購入に使用する予定である。