Peripheral nerve regeneration using purified stem cells of neural crest-like cells derived from human induced pluripotent stem cells

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09080
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 佐藤 和毅 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 教授 (60235322)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中村 雅也 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 教授 (30217898) ; 名越 慈人 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (10383837) ; 芝田 晋介 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (70407089) ; 黄地 健仁 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (30803564)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: iPS細胞 / 末梢神経再生 / 神経堤様細胞

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、末梢神経再生に向けて自家神経移植と同等以上の機能回復を示すヒトiPS細胞を用いたハイブリッド型人工神経を開発することです。末梢神経の欠損・損傷は四肢の外傷や悪性腫瘍摘出術後などにしばしば発生します。欠損のない損傷は直接縫合が可能で臨床成績も比較的良好ですが、神経の欠損により一次縫合が困難な例の治療は非常に難渋します。現在、自家神経移植術や神経移行術が行われていますが、これら自己の神経を犠牲にする治療は当該神経の脱落症状や採取可能な神経長の限界など多くの問題を有します。近年、人工素材を用いたチューブ型人工神経も実用化されていますが、その機能回復は自家神経移植術に劣り、満足なものではありません。申請者のグループは、長年の脊髄再生研究で培ってきた知見・技術を礎にして、これまでにない機能回復に優れた人工神経の開発を行っています。
本研究では、Ⅰ.移植細胞、Ⅱ.移植媒体（scaffold）、Ⅲ.周囲環境（動物、液性因子、急性期と慢性期の違いなど）に分けてハイブリッド型人工神経の開発を行います。すなわち、以下の3つのステップで研究を進めます。
Ⅰ.ヒトiPS細胞由来細胞を誘導し、細胞表面マーカーを用いて分離後、マウスの坐骨神経の欠損部に移植し、その再生に寄与することを各種画像検査、運動機能評価検査、電気生理学的検査等を用いて評価する。
Ⅱ.そのヒトiPS細胞由来細胞が、適切な環境で生着及び各種誘導因子を行えるような移植媒体（scaffold）を作成する。
Ⅲ．マウスからヒトへの移植を視野に入れ、動物の変更だけでなく、安全性、多岐にわたる欠損型（欠損長、神経横径など）、その移植時期に向けた各種検討を行う。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2種類のヒトiPS細胞株（201B7細胞株およびWD39細胞株）を用いて、神経堤様細胞に誘導後、LNGFR及びTHY-1に加えて神経細胞接着因子であるNeural cell adhesion molecule(NCAM)を加えた3種類の細胞表面マーカーを用いてフローサイトメトリーを用いて純化することに成功しました。in vitro解析において、NCAMはヒトiPS細胞由来神経堤様細胞の中でも特にLNGFR陽性THY-1陽性の細胞集団での発現率が高い（約80％）ことが明らかになりました。
この細胞集団の移植効果を評価するために、免疫抑制マウスの広範囲坐骨神経欠損モデルにシリコンチューブに細胞を封入して移植しました。バイオイメージングを用いた移植細胞の生存・増殖、運動機能を継時的に追跡・評価し、術後12週における電気生理学的評価、組織学的評価を行い、細胞移植を行っていない非細胞移植群や自家神経移植群と比較検討しました。バイオイメージングにおいては、申請者のグループが過去に報告したLNGFR、THY－１の2種類の細胞表面マーカーで純化した細胞集団を移植した際は、術後12週間経過した段階でも発光量は増加を続けており、移植細胞は生存し増殖傾向を有していましたが、この3種類で純化した細胞集団を移植した本実験においては、術後8週以降で発光量の低下を認め、移植後一定期間を経過すると細胞の増殖能を示さないことが明らかになりました。
また、術後12週における組織学的評価では、細胞移植を行っていない非細胞移植群と比較して有意な軸索再生の改善が認められましたが、移植細胞由来の細胞は残存しておらず、移植細胞による腫瘍化や目的外分化は認められませんでした。さらに、運動機能評価および電気生理学的評価において、細胞移植群が非細胞移植群に対して有意かつ自家神経移植群に匹敵する機能改善を示しました。

Strategy for Future Research Activity

最適な移植媒体（scaffold）を検討します。これまでの実験では移植細胞をコラーゲン（新田コラーゲン、Type1A）に封入し、そのコラーゲンをシリコンチューブ内に封入していました。シリコンチューブは、その形状の安定性と種類の豊富さから様々な神経径での移植や縫合に適しており、安定性、弾力性にも優れています。申請者のグループが行ったこれまでの実験では、四肢の動きに伴う縫合部破綻は一例もありませんでした(マウス)。しかし、臨床においては、人工神経の素材は生体吸収素材であることが必須です。申請者のグループは、コラーゲンのみによるscaffold作成や縫合強度の調整が可能な他の生体吸収素材を使ったscaffold作成の準備を始めています。平成31年度中に最適な素材を決定し、scaffoldを作成する予定です。

Causes of Carryover

平成30年度は試薬、マウスなどにかかる費用が抑えられたため、実使用額が想定された使用額よりも少なくなりました。
令和元年度は移植媒体（scaffold）の開発、それを使ったin vivo実験が始まり、平成30年度の差額も使用することになると思います。