幹細胞による安全な軟骨再生医療のための脂質分化マーカーの探索とその機能の解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09090
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 馬場 力哉 北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (40815742)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩崎 倫政 北海道大学, 医学研究院, 教授 (30322803) ; 小野寺 智洋 北海道大学, 大学病院, 講師 (70547174)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 糖鎖 / iPS細胞 / Glycoblotting法

Outline of Annual Research Achievements

本研究はより安全で効率的なiPS細胞を用いた軟骨再生医療を実現することを目指す。本研究では ①ヒトiPS細胞から軟骨細胞への分化過程で特徴的な構造変化を示す糖鎖が存在する。その糖鎖を制御することで、高効率かつ特異性の高い分化誘導法が確立できる。 ②未分化iPS細胞に特異的抗体を用いることで、分化iPS細胞の活性を下げることなく選択的に未分化iPS細胞を除去できる。 という２つの仮説を検証する。
まず仮説①に対し、我々は先行研究でGlycoblotting法によりマウスiPS細胞から軟骨細胞分化誘導系において、特徴的な構造変化を示す糖鎖（Fucosyl GM1）が増加することを報告した(Hontani et al., 2017)。この結果から、ヒトiPS細胞から軟骨細胞への分化過程でも、マウスのような特徴的な構造変化を示す糖鎖が存在するかを本研究で検証する。
仮説②については、抗体は立命館大学との共同研究により提供されたR-17Fを用いた。R-17F(Matsumoto et al., 2015)はiPS細胞に特異的な抗体で、未分化iPS細胞にのみ発現する糖鎖構造(H-type1)を認識し、容量依存性にiPS細胞に細胞傷害性を持つ。我々はまず、R-17Fの未分化ヒトiPS細胞への結合能を、ヒトiPS Cell line, 201B7, 606A1を用い、R-17Fの２次抗体を用いた免疫染色によって証明した。次に、R-17FのiPS、軟骨細胞への細胞傷害性の評価について、606A1、ヒト軟骨細胞cell line、C28/I2を用い、抗体と反応させた後に死細胞をPIで染色後、Flow Cytometryで定量評価したところ、iPS細胞に抗体を加えた群は死細胞が70%であったのに対し、軟骨細胞は15%とcontrolとほぼ差を認めなかった。現在、さらなる検証実験を計画中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

仮説①に対しては、ヒトiPS細胞から軟骨への分化過程での糖鎖解析はすでに終了している。仮説②に対しても、in vitroでの実験はほぼ終了しており、in vivoの実験も現在進行中であるため。

Strategy for Future Research Activity

仮説①については、京都大学と共同研究で提供された、ヒトiPS細胞由来の軟骨sampleをコントロールとし糖鎖解析を行う。糖鎖解析の際、同一な解析条件が求められるため、すべてのsampleを揃う4月末頃に一括で解析する予定である。
仮説②については、R-17Fによるteratoma発生抑制効果の評価について評価予定である。またヒトiPS由来軟骨細胞に対するR-17Fの効果の検討も予定しており、京都大学から検体が届き次第評価する予定である。糖鎖解析を用いたiPS細胞除去効果の確認についても、現在さらなる解析を進めている。

Causes of Carryover

今後の予定で記載した通り、実験はおおむね順調であるが、当該年度で達成しきれなかった仮説①、仮説②の実験に関して今後も継続が必要であるため、これらを実施するための費用として次年度に使用する予定である。