2019 Fiscal Year Research-status Report
幹細胞による安全な軟骨再生医療のための脂質分化マーカーの探索とその機能の解明
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18K09090
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
馬場 力哉 北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (40815742)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩崎 倫政 北海道大学, 医学研究院, 教授 (30322803)
小野寺 智洋 北海道大学, 大学病院, 講師 (70547174)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ヒトiPS細胞 / Fucosyl GM1 / 細胞特異的糖鎖解析 / R-17F |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はより安全で効率的なiPS細胞を用いた軟骨再生医療を実現することを目指す。本研究では ①ヒトiPS細胞から軟骨細胞への分化過程で特徴的な構造変化を示す糖鎖が存在する。その糖鎖を制御することで、効率的な分化誘導法が確立できる。②細胞特異的糖鎖解析の手法を用い、軟骨細胞中の残存するiPS細胞を検出、定量化する事ができる、という2つの仮説を検証した。
仮説①に対し、我々は過去にマウスiPS細胞から軟骨細胞分化過程で、Fucosyl GM1糖鎖が増加することを示した。ではヒトiPS細胞から軟骨細胞への分化過程でも特徴的な構造変化を示す糖鎖が存在するかを検証した。ヒトiPS細胞から間葉系幹細胞様細胞(iPS-MSCs)を介して軟骨細胞へ分化誘導し、経時的な糖鎖構造の変化を解析した。その結果、マウスiPS細胞でみられたFucosyl GM1糖鎖のヒトでの発現はみられなかった。ヒトiPS-MSCsの糖鎖profilingは分化に伴いDay1と比してDay21で健常軟骨の発現パターンと類似した。
次に仮説②に対し、未分化iPS細胞は表面を特異的な糖鎖(SSEA-3,4, LNFP 1)に覆われており、分化するとそれらは速やかに消失する(Liang et al., 2010)。そこで我々は細胞特異的糖鎖解析の手法がiPS細胞の検出、定量化に有用と着想した。iPS、軟骨細胞を様々な比率で混合し、糖鎖解析を実行した。結果、iPS細胞の検出が可能であり、iPS含有量と特異的糖鎖量は正の相関を示した(R2 = 0.965)。次にLNFP 1 糖鎖を認識し、細胞傷害性を持つ抗体R-17F(Matsumoto et al., 2015)のiPS細胞除去効果を糖鎖解析の手法で検証した。iPS、軟骨細胞の共培養にR-17Fで処理した後、糖鎖を解析した。結果、iPS特異的糖鎖は10から4%に減少した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
仮説①に対しては、ヒトiPS細胞から軟骨への分化過程での網羅的糖鎖解析を終了し、２回目の糖鎖解析においても結果の再現性が得られたため、論文を作成中である。仮説②に対しては、細胞特異的糖鎖解析による未分化iPS細胞の検出、定量化法を確立し、その成果を報告した(Miyazaki et al., IJMS, 2019)。
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| Strategy for Future Research Activity |
仮説①については、結果を纏めて、今年度内に論文を完成する。
仮説②で確立した細胞特異的糖鎖解析による未分化iPS細胞検出法では、iPS特異的糖鎖を認識し、細胞傷害性を持つ抗体R-17Fで24h処理することにより、iPS細胞は10から4%まで減少することがわかった。そこで我々は次の段階として、R-17Fのteratoma発生抑制効果について検証する。残存するiPS細胞 がより少なくなるR-17Fの使用条件を確立し、その上で軟骨、未分化iPS細胞の共培養モデルにR-17F処理を加えたものを免疫不全マウス(SCID mice)の精巣に移植し、teratoma発生の有無を検証する予定である。
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| Causes of Carryover |
前述した仮説①に対する結果を次年度にまとめる予定であり、論文の執筆中である。追加実験や成果を学会で発表する際に残額を使用する予定である。
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