感染・偽関節の阻止を目指した革新的な骨折治療法に関する基礎的検討

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09094
• Research Institution: Teikyo University
• Principal Investigator: 日高 亮 帝京大学, 医学部, 助手 (70761451)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 栄 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (50282661) ; 石原 一彦 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 教授 (90193341) ; 茂呂 徹 東京大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (20302698) ; 高取 吉雄 東京大学, 医学部附属病院, 客員研究員 (40179461) ; 田中 健之 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (00583121)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 医療・福祉

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、「生体細胞膜を模倣した生体親和性合成リン脂質材料・MPCポリマー(PMPC)による細胞・タンパク質の付着抑制効果」を基盤技術として「骨折治療用機器(プレート、ピン等)表面のPMPC処理方法」を確立し、「細菌付着・バイオフィルム形成の抑制による感染・偽関節の阻止を目指した革新的な骨折治療法」を創出するための基礎研究を完成させることである。骨折治療における感染・癒合不全は深刻な合併症である。日本発の独自材料により、「工業的製造に対応できる簡便なプロセス」または「臨床上行われている消毒操作」というシンプルな方法で骨折治療用医療機器の表面に細菌付着・バイオフィルム形成抑制層を形成するところに本研究の独創性がある。医工連携研究により「PMPC処理条件の最適化」、「in vitro/vivo感染症モデルを用いた細菌付着・バイオフィルム形成抑制効果の検討」という２つのサブテーマに取り組み、革新的な骨折治療法を創出し、助成期間終了後に速やかに臨床試験に移行できるように基礎研究を完成させる。今年度は、以下の検討を行った。
1. PMPC処理条件の最適化： PMPCによるナノ表面処理について、2018年度からのin vitro感染症モデルの結果をフィードバックし、PMPCの組成、溶液濃度、処理時間等の至適条件を検索した。
2. In vitro/vivo感染症モデルを用いた細菌付着・バイオフィルム形成抑制効果の検討：「1. PMPC処理条件の最適化」で絞り込んだ処理方法でディスク表面をPMPC処理し、生体内を模した流動環境におけるin vitro感染モデルに用い、バイオフィルム形成黄色ブドウ球菌等の付着抑制効果・バイオフィルム形成抑制効果を検討した。
以上の結果は、革新的な骨折治療法を創出するための基礎検討を推進するための確信を得るに十分な結果であった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1. PMPC処理条件の最適化(達成度100%)
骨折治療用の医療機器に用いられる金属材料であるステンレス、チタン合金を用いて評価した。各々の金属表面のPMPCによるナノ表面処理について、2018年度からのin vitro感染症モデルの結果をフィードバックし、PMPCの組成、溶液濃度、処理時間等を変化させ、至適条件を検索した。試料表面の水接触角を測定し親水性を評価した。また、X線光電子分光分析、赤外分光光度分析で観察し、PMPCユニットの同定および処理率を計測した。さらに透過型電子顕微鏡にて処理層の厚みを測定した。
2. In vitro/vivo感染症モデルを用いた細菌付着・バイオフィルム形成抑制効果の検討(達成度100%)
In vitro感染モデルにおける評価：ステンレス、チタン合金の表面にPMPCで表面処理したディスクおよび、未処理のディスクを用意し、表面に手術部位感染（SSI）の主な病原菌である、バイオフィルム形成黄色ブドウ球菌を播種した。生体内の環境をもした流動環境下におき、37℃にて1時間ならびに24時間培養して評価した。1時間の培養では細菌付着の程度を、24時間の培養ではバイオフィルム形成に関して評価した。付着生菌数の計測、蛍光顕微鏡、走査型電子顕微鏡（SEM）の観察を行い、その表面では細菌付着が顕著に抑制されること、バイオフィルム形成が抑制されることを明らかにした。

Strategy for Future Research Activity

1. PMPC処理条件の最適化：
2018年度のタンパク質吸着抑制効果の検討、表面電位の検討、静置環境における感染抑制効果の結果、2019年度の流動環境における感染抑制効果の結果をフィードバックし、細菌付着・バイオフィルム形成を効率的に阻止する至適処理条件を確立する。a) X線光電子分光分析、b) 赤外分光光度分析、c) 透過型電子顕微鏡による処理層の厚み測定、d) 表面の水接触角計測等により評価する。
2. In vitro/vivo感染症モデルを用いた細菌付着・バイオフィルム形成抑制効果の検討
1) In vitro感染モデルにおける評価：1.で絞り込んだ処理方法を用い、ステンレス、チタン合金製のディスク表面をPMPC処理する。24穴プレート中に試験片を配置し、細菌を播種する。細菌は手術部位感染（SSI）の主な病原菌である、バイオフィルム形成黄色ブドウ球菌等を使用する。37℃にて培養環境下で抗菌薬を24時間作用させた後試験片を回収し、以下の検討を行い、PMPC処理によるバイオフィルム形成抑制効果を検討する。a) 付着生菌数測定、b) 蛍光顕微鏡観察、c) 走査型電子顕微鏡観察、d) バイオフィルム厚の評価。
2) マウス皮下感染モデルにおける評価：マウスの背部皮下にPMPC処理を施した金属試験片を挿入後、細菌を接種して縫合する。3日後に試験片を摘出して以下の検討を行う。a) 付着生菌数測定、b) 蛍光顕微鏡観察、c) 走査型電子顕微鏡観察、d) バイオフィルム厚の評価。

Causes of Carryover

In vitro/vivo感染モデルに使用する試験片の購入を予定していたが、表面の研磨、表面処理、滅菌の工程に時間を要し、今年度中の納品ができなかったため、2020年度に発注・購入することとした。なお、このことにより研究が遅れることはない。