Role of tissue factor in diabetic osteoporosis

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09123
• Research Institution: Kindai University
• Principal Investigator: 辰巳 公平 近畿大学, 医学部, 講師 (70555432)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: Tissue factor / 糖尿病 / 骨密度 / 骨修復 / 骨粗鬆症

Outline of Annual Research Achievements

初年度は、LowTFマウス（TF発現が正常の1-2%に減弱しているマウス）を用いて、in vivoにおける糖尿病における糖代謝異常、骨代謝異常へのTFの関与を明らかにするための実験を行った。
まず、8-10週齢の野生マウス（C57BL/6）にストレプトゾトシン（STZ）を200 mg/kgの用量で単回腹腔内投与して１型糖尿病を誘発した。対照群には同用量のPBSを腹腔内投与した。糖尿病化の確認４週後に、脛骨・筋肉を採取してリアルタイムPCRによるTF発現の定量を行った。また、屠殺前に脛骨の定量CT解析を行い、海綿骨と皮質骨の骨密度定量を行った。結果、糖尿病発症マウスは対照マウスに比べ、４週間の体重増加率が有意に低値であった。骨密度は、皮質骨密度には有意な変化は認めなかったが、海綿骨密度は糖尿病化マウスが対照マウスに比べ有意に低く、糖尿病性骨粗鬆症の誘発が確認できた。また、脛骨や筋組織におけるTF遺伝子発現量は、糖尿病誘発により増加することが確認された。
次に、骨損傷後の骨修復過程にTF欠損状態がおよぼす影響を調べる目的で、LowTFマウスおよび野生型マウスの片側大腿骨にドリルにて径0.5 mmの骨欠損孔を作成し、経時的にCT撮影を行い、その欠損孔サイズを定量化した。結果、LowTFマウスの骨修復は野生型マウスより早期に完了することが観察され、TF欠損状態が骨修復機転に促進的に働く可能性が示唆された。しかし、同様の実験を糖尿病化させたマウスを用いて行ったところ、LowTFマウスの方が骨修復が遅延するという逆の傾向が認められた。なお、定常状態での骨密度においては、LowTFと野生型マウス間で有意差は認めなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度に本研究の基盤となるin vivo実験を基礎データが得られた。今後はこのデータを元に、主に培養細胞等を用いたin vitro実験にて機序の解析に進む予定である。

Strategy for Future Research Activity

糖尿病下・非糖尿病下にてLowTFマウスと野生型マウスの間で観察された骨修復回復過程の相違について、個体数を増やして再現実験を行うことにより実験結果の確認を行うとともに、その分子機序についての検討を進める。具体的には、骨組織サンプルを用いて、免疫組織化学および分子生物学的解析を用いた骨芽細胞分化・増殖能解析、破骨細胞形成・骨吸収関連遺伝子評価、軟骨・血管形成関連分子の解析、脂肪・凝固線溶関連分子の評価などを行うとともに、血中骨代謝マーカー（CTX、骨型ALP、オステオカルシン）の評価を行う。さらには、Low TFマウス由来の初代培養細胞やTFを過剰発現あるいはノックダウンさせたマウス細胞株を用いて、TFが骨芽細胞系、破骨細胞系、脂肪細胞、肝細胞、骨格筋細胞に及ぼす作用のメカニズムを、凝固線溶系を介する機序と介さない機序の両者の視点から、さらに網羅的遺伝子解析を用いて、TFが作用することにより誘導されるシグナルを探索する。骨芽細胞系としては、新生仔マウス頭蓋骨由来初代培養骨芽細胞、BMP-2添加骨髄細胞培養系、間葉系幹細胞、あるいはマウス骨芽細胞株（MC3T3-E1細胞）や間質細胞株(ST2, 10T1/2細胞)を、破骨細胞系の検討として、初代培養骨髄細胞、およびマウスマクロファージ様破骨前駆細胞株(Raw264.7細胞)を使用する予定である。