2018 Fiscal Year Research-status Report

Exploring novel downstream targets of VBC-Cul2 complex in clear cell renal cell carcinoma

Research Project

Project/Area Number	18K09140
Research Institution	Kumamoto University
Principal Investigator	神波大己熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (20402836)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	馬場理也熊本大学, 国際先端医学研究機構, 准教授 (10347304) 矢津田旬二熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (20749626) 元島崇信熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (60726355) 村上洋嗣熊本大学, 医学部附属病院, 助教 (70735703) 荒木令江熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 准教授 (80253722)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	腎癌 / VHL / 新規標的分子 / ３次元培養
Outline of Annual Research Achievements	１）平成30年度成果の具体的内容これまでに我々が樹立した786-O/TR-pVHL細胞におけるpVHL発現レベルと誘導効率をウエスタンブロットで検証した。ドキシサイクリン添加により効率よくpVHLの発現が誘導され、未添加の状態では長時間露出でわずかにpVHLの発現を認める程度であった。低酸素応答エレメントを組み込んだルシフェラーゼコンストラクトを用い、pVHLの発現誘導によるHIFαの分解機能を評価した。親株とTetRのみ発現する786O細胞では高い低酸素応答エレメントに対する転写活性を示したが、786-O/TR-pVHL細胞ではドキシサイクリン添加の有無に関わらずHIFαの転写活性が抑制されており、ごくわずかのpVHLによりHIFαが分解されている事が明らかになった。これと並行してVHL nullの786-O細胞と、786-O細胞にVHLを安定発現させたWT8細胞を用いて３次元培養実験系を構築中である。別に、CRISPR/Cas9でVHL遺伝子をノックアウトする為のターゲティングベクターを作成し、ヒト近位尿細管上皮細胞株HK2でVHL欠損株を作成した。２）本成果の意義、重要性 786-O細胞系およびHK２細胞株の双方で、pVHL発現の有無によるトランスクリプトーム解析、プロテオミクス解析を実行することにより、VBC-Cul2複合体の新規標的分子をより精度高く同定することが期待される。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 786-O/TR-pVHL細胞を用いて実験を開始したが、当初予想された３次元培養でのsphere形成能に有意な差異を認めなかった。pVHLの発現とHIFαの転写活性を検証したところ、ドキシサイクリン未添加でのごくわずかのpVHL発現でもHIFαの転写活性が抑制されている事が明らかになった。一方で並行して進めていたバックアップの系で、HK2細胞におけるVHL遺伝子のノックアウトに成功するとともに、発現誘導の系ではない786-OとWT8の系で3次元培養を検討中である。
Strategy for Future Research Activity	引き続き786-O/TR-pVHL発現誘導系の再確立を目指すが、上手くいかない場合の救済実験系として誘導発現系ではないが、786-Oを親株としpVHLを安定発現しているWT8を用いて、3次元培養における検討を継続する。また腎細胞癌の発生由来は近位尿細管細胞とされており、近位尿細管におけるVHL欠損が発癌の初期イベントと考えられているため、ヒト近位尿細管細胞株HK2を用いてCRISPR/Cas9によりVHL遺伝子をノックアウトする系を確立した。これら２ないし３の実験系を用いて、当初計画していた３次元培養ならびにオミクス解析を行っていく予定である。
Causes of Carryover	以前に樹立し凍結保存されていた786-O/TR-pVHL細胞を用いて実験を開始したが、当初予想された３次元培養でのsphere形成能に有意な差異を認めなかった。そこで改めてpVHLの発現について検証したところ、本来はドキシサイクリン添加によりpVHLの発現が誘導されるべきであるが、未添加の状態でもpVHLの高発現が認められたため、pVHL誘導発現系細胞株を再作成する必要が生じた。そのため当該年度に計画されていたプロテオミクス解析やトランスクリプトーム解析といった網羅的解析まで進むことができなかったことが次年度使用額が生じた最も大きな要因である。翌年度分として請求した助成金と合わせ、発現誘導系の再構築、および既に確立している救済実験系を用いた３次元培養、網羅的解析に使用する計画である。