Exploring novel downstream targets of VBC-Cul2 complex in clear cell renal cell carcinoma

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K09140
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 神波 大己 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (20402836)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 馬場 理也 熊本大学, 国際先端医学研究機構, 准教授 (10347304) ; 矢津田 旬二 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 講師 (20749626) ; 元島 崇信 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (60726355) ; 村上 洋嗣 熊本大学, 病院, 助教 (70735703) ; 荒木 令江 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 准教授 (80253722)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 腎癌 / VHL / 新規標的分子 / 3次元培養

Outline of Annual Research Achievements

平成31／令和元年度までに、786-O/TR-pVHL細胞ではドキシサイクリンの有無に関わらずHIFα転写活性が抑制されており、ごくわずかのpVHLによりHIFαが分解されている事が明らかとなったため786-O親株と、空ベクター導入株pRC3及びVHL導入株WT8を用いて3D培養系を確立するとともに、VHLの有無による低酸素応答遺伝子発現レベルの差を2D培養と3D培養で比較検討し、培養条件の最適化を行い、3D培養下においてVHLの新たな標的たんぱく質を見出す妥当性が検証できたため、令和2年度はプロテオミクス解析に着手した。細胞内アルギニン及び/又はリシンを安定同位体ラベルしたpRC3(VHL-)、WT8(VHL+)、WT8にHIF安定化剤であるRoxadustatを添加したものを3D培養し、SILAC（Stable Isotope Labeling using Amino Acids in Cell Culture）法によるプロテオミクス解析を行った。同定された3598種のたんぱく質のうち、VHLの発現により有意に減少するものは331種あった。このうち、VHL導入細胞においてRoxadustat添加で有意に発現が増加し、HIFの増加に関連すると想定される分子は254種あった。さらにRNAシーケンスによる網羅的遺伝子発現解析を行い、プロテオミクス解析で変動しているpVHL標的候補タンパク質のうち、mRNAレベルで変化のあるものと無いものに分類して解析を進めた。興味深い新規標的候補として、mTORシグナル経路の重要分子や、淡明細胞型腎細胞癌の予後と有意な相関がみられる酸化ストレス関連分子などを見出した。現在、pVHLによるこれらの分子の発現制御機構や発がんに果たす役割、更に新規治療標的としての可能性に関して、解析を進めている。