Transgenic spermを用いた卵活性化因子PLCζの機能解析

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09144
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 窪田 裕樹 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (10347403)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安井 孝周 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (40326153) ; 梅本 幸裕 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (80381812) ; 岩月 正一郎 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (70595397) ; 野崎 哲史 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 臨床研究医 (50813432)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 精巣内遺伝子導入 / PLC zeta

Outline of Annual Research Achievements

PLCζ遺伝子を単離するべく、マウス精巣のcDNAライブラリーから既知のプライマーを用いて、全長(2.2Kb)にわたりPCR法により増幅させた。得られたPCR産物をゲル電気泳動により単離したのち精製したものを、TOPOベクターにサブクローニングしておいた。全長にわたりシーケンスを解析して全塩基配列がPLCζ遺伝子として正しいことを確認した。
このPLCζ遺伝子を制限酵素で切り出して、GFPまたはYFP遺伝子を含むベクターに融合蛋白を発現するようにサブクローニングした。さらにPLCζ遺伝子+GFPまたはPLCζ遺伝子+YFPを制限酵素で切り出して、サイトメガロウィルスのエンハンサーとchickenのβ-actin プロモーターを含むpCAGベクターに組み込んで、融合蛋白の発現ベクターを作成した。また、コントロールとしてGFPまたはYFP遺伝子のみを発現するベクターも作成しておいた。
融合蛋白の解析を行うために、HEK293細胞に燐酸カルシウムを用いて前述の融合蛋白発現ベクターを遺伝子導入した。融合蛋白を正しく発現することを確かめるために、48時間の培養の後にHEK293細胞から淡白を抽出した。ウェスタンブロット法により合成された蛋白が、予想される分子量と一致することを確認した。
In vivoで融合蛋白発現ベクターの遺伝子導入を行うには、大量のベクターが必要であるため、上記で作成したベクターを、TOP10細胞をcompetent cellとして十分な量が得られるまで増幅しておいた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

PLCζ遺伝子の全長にわたるクローニングおよび正しく融合蛋白を発現するベクターの作成に難渋したため。
また、大量のベクターを作成する必要があり、ベクターの増幅にも時間がかかった。

Strategy for Future Research Activity

若干の遅れはあるが、概ね想定の範囲内で進行している。
今後は予定通り、in vivoでの遺伝子導入を行い、transgenic spermを作成する。
効率良くtransgenic spermを作成するための条件設定については十分な検討が必要である。

Causes of Carryover

年度末までの計画が早期に終了し、また次のステップの研究にかかる試薬の挿入が年度を超えたので、次年度使用額が生じた。引き続き計画に沿ってTransgenic spermを用いた卵活性化因子PLCζの機能解析を進めていく