Functional analysis of PLC zeta using transgenic sperm.

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K09144
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 窪田 裕樹 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (10347403)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安井 孝周 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (40326153) ; 梅本 幸裕 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 教授 (80381812) ; 岩月 正一郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (70595397) ; 野崎 哲史 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (50813432)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: PLC zeta / エレクトロポレーション / transgenic sperm

Outline of Annual Research Achievements

PLC zetaと標識タンパクであるGFPおよびYFPとの融合タンパクを発現するベクターを作成し、マウス精巣内への遺伝子導入を繰り返し行う過程で、導入効率はGFPの方が若干優れていることが確認できた。以降の研究は、PLC zetaとGFPの融合タンパクを発現するtransgenic spermの作成を目標とした。
ICR系雄マウス（４～６週齢）の精巣内にエレクトロポレーション法に基づいて遺伝子導入を行った後、2～3週の期間をおいて、上記マウスを屠殺して精巣組織を摘出して、蛍光顕微鏡下で融合タンパクの発現を検討した。当初は精細胞への導入効率が低く、精子細胞および精子への融合タンパクの発現は非常に困難で、ごく少数の融合タンパク発現精子（transgenic sperm）を確保するにとどまっていた。今年度の途中からようやく、効率的にtransgenic spermを回収することが可能となり、精子全体のおよそ2％程度に融合タンパクの発現が見られるようになった。
得られたtransgenic spermを用いて、同系統の雌マウスを過剰排卵させて採卵したものとIVFに供したが、精子運動率が低く受精を確認することは出来なかった。そこで卵細胞質内精子注入法（ICSI）を施行したところ、一部の卵細胞で分裂が見られたが、胚盤胞の形成は明らかではなかった。
蛍光顕微鏡下で受精のプロセスを観察したが、融合タンパクの発光が速やかに失われてしまい、実際に融合タンパクの挙動を観察することは困難であった。卵細胞質内のCa濃度の上昇は確認できたが、卵活性化のトリガーであるCa oscillationと同一であることの証明はできなかった。