流れストレスと伸展刺激による機能的尿路組織の作製と臨床応用への試み

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09176
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 丸山 哲史 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 高度医療教育研究センター教授 (50305546)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安井 孝周 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (40326153) ; 林 祐太郎 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (40238134) ; 水野 健太郎 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (70448710) ; 中根 明宏 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (70464568)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ホローファイバー / 伸展刺激 / 細胞工学 / 上皮間葉誘導 / 再生医療 / KIT陽性細胞 / 尿路上皮細胞 / シェアーストレス

Outline of Annual Research Achievements

作成した平滑筋細胞層が組織全体としての方向性と強弱をもった統一性のあるいわゆる蠕動運動を誘起し、効率的な尿移送が可能となった。ホローファイバーシステムに律動的な電気刺激を加えることで平滑筋組織に方向性をもった空間的配置が確立され、電気的結合も強化された。更に、サイトカイン刺激を加えることでKit陽性間質細胞がこのシステム内に誘導され、平滑筋組織に自動能がもたらされることが示唆された。
尿路再建術に際しては、摘除した尿管組織の補填材料として生体適合性のある機能的な組織が必要とされる。しかし、培養細胞を材料とした組織では力学的強度が不十分であり、また臨床応用可能な必要量が確保できないなどの課題があった。われわれは、これまでホローファイバー（中空糸）システムを用いて、幹細胞から再生した尿路上皮細胞と平滑筋細胞とを流体下で共培養する手法により、力学的な強度を持つ尿路組織を作製した。さらに電気刺激とサイトカイン刺激により細胞間接着を強化するとともに間質細胞を分化誘導し、自己調節能力を有し蠕動運動が可能な管腔組織を作製した。作製された管腔組織は、尿管などさまざま部位での尿路再建手術に臨床応用が可能な生理的な手術材料となることが示唆された。
実際の臨床応用においては組織レベルの物理的サイズと強度が必要で、プロセスの更なる効率化が課題である。出発点としてES細胞などを用いればより非侵襲的な方法となる。ES細胞由来の細胞群を基に尿路上皮やその周囲の組織を得ることも検討中である。今までとは違った治療法へ発展させる事ができる可能性も示唆された。尿路上皮や平滑筋の幹細胞が利用できれば、未分化状態を維持したままの分裂増殖により、大きく欠損した尿路を補うのに十分な量の新しい組織を得ることが可能である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ホローファイバー（中空糸）を用いた尿路上皮細胞の培養：中空糸周囲空間（extra capillary space/ ECS）に細胞を培養した。中空糸は高い物質交換特性を持ち、細胞に養分と酸素を供給し、老廃物（アンモニア、乳酸）を除去する。ポンプを用いて培養液を環流させることで、自動的に栄養を供給し老廃物を除去できる。中空糸の外径は200-630μm、膜厚は8-150μmとなる。透析面積は123-2200cm2, ECS 1.4-12mlである。このシステムを用いて尿路上皮に対して、経時的に細胞数の算定および位相差顕微鏡での形態観察を行った。その増殖能、活性および形態学的特徴を評価し、最適な培養期間および培養の条件等を検討した。ホローファイバーシステムは、中空糸周囲空間（extra capillary space/ ECS）に大量の細胞を培養することを目的に開発された。中空糸は高い物質交換特性を持ち、細胞に養分と酸素を供給し、老廃物（アンモニア、乳酸）を除去する。ポンプを用いて培養液を環流させることで、自動的に栄養を供給し老廃物を除去できる。その増殖能、活性および形態学的特徴を評価し、最適な培養期間および培養の条件等を検討した。
流れ刺激により上皮細胞は上皮間葉誘導を来たし平滑筋およびKit陽性間質細胞へと再分化する可能性がある。間葉系細胞のマーカーであるビメンチンの分布を検討した。さらに、KitリガンドであるStem Cell Factor (SCF)を加えることでKit陽性間質細胞をこのシステム内に誘導し、平滑筋細胞層が組織全体としても統一性ある運動（いわゆる蠕動運動）をすることを電気生理学的および薬理学的に確認した。

Strategy for Future Research Activity

上皮間葉(EMT)誘導：一部の上皮細胞はEMTを来たし平滑筋へと再分化した。その過程を免疫組織学的に追跡する。この際には、上皮系細胞のマーカーであるサイトケラチンと間葉系細胞のマーカーであるビメンチンの分布を検討する。アクチンミクロフィラメントやギャップジャンクションを確認する。
ES細胞への遺伝子導入、尿路上皮細胞系の確立：Hox、 Wnt、BMP4及びBMP7など腎・尿管発生（特に尿路上皮）に重要な働きをしている遺伝子のcDNAを鋳型にPCRで遺伝子を増幅し、プラスミドベクターに組み込む。ES細胞に対して遺伝子を導入したのち、LIFを除いた培養液中でhanging drop法を用いembryoid body（胚様体：EB）を形成させ、分化させる。5日後にEBを再度ディッシュに付着させて分化を進め、時間の経過とともに細胞を回収し、他の尿路発生の各段階で発現してくる遺伝子に変化がないかどうまた細胞の形態変化なども評価する。以上の実験において特出される導入遺伝子とそれに対応して発現する遺伝子群、また分化させたときの形態などから標的となる尿路上皮（移行上皮）やその周囲の組織（平滑筋など）を同定し、その特異的な抗原を用いたflow cytometry で細胞のソート（FACS）を施行し、単一の前駆細胞の抽出を検討する。
重層的な研究体制を構成することで組織の安定化を図る。ホローファイバーシステム作製、マトリックス作製、動物実験（ラット）・細胞培養・遺伝子発現解析などそれぞれの技術に習熟した研究者の協力のもとに実験を遂行する。効率的に研究を進めるため研究方法ごとに研究者を分担する。