2018 Fiscal Year Research-status Report
Identification of the upstream regulatory genes specific to the subtypes of uterine leiomyoma without the MED12 mutation
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18K09262
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
佐藤 俊 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (10534604)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 子宮筋腫 / 遺伝子発現 / 発生・進展 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、MED12遺伝子の突然変異が子宮筋腫の約70％で検出され、筋腫発生に関与するドライバー変異であることが示唆された。一方、残り30％のMED12変異がない子宮筋腫（MED12(-)筋腫）では未だ発生機序の手掛かりは得られていない。我々はこれまでにMED12変異の有無で筋腫のDNAメチル化プロファイルが異なること、さらにMED12(-)筋腫にはメチル化プロファイルが異なる3つのサブタイプが存在することを見出し、サブタイプ毎の解析によりMED12(-)筋腫の発生機序が解明できる可能性に至った。本研究では、各サブタイプにおける筋腫発生に関わるマスター遺伝子の同定とその作用機序の解明を目指して、平成30年度は以下の項目について研究を進めた。
Ⅰ. MED12(-)筋腫の各サブタイプに特異的なマスター遺伝子候補の選出：我々はこれまでに筋腫の発生にはエピ変異により発現変異したマスター遺伝子が関与するという仮説の基、DNAメチル化とmRNA発現データを用いた統合解析による候補遺伝子の抽出法を確立している。本研究でも同様にMED12(-)筋腫の各サブタイプについて候補遺伝子を抽出するため、サブタイプ毎に3検体以上を回収し、DNAメチロームとトランスクリプトームデータを得た。現在、得られたデータを基に各サブタイプに特異的なマスター遺伝子候補を選出している。
Ⅱ．in vivoにおける腫瘤形成を指標にしたマスター遺伝子の同定：子宮筋腫では平滑筋細胞が筋腫細胞に変化したことを示すマーカーがないため、培養系での機能解析が難しい。そこで候補遺伝子の発現を改変したヒト培養細胞をマウスの腎被膜下に移植する異種移植系を用い、腫瘤形成を指標に機能解析を行う。この異種移植系により、候補遺伝子から筋腫の発生に関与するマスター遺伝子を同定する。現在、筋腫細胞をコントロールとして移植系を立ち上げている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成30年度の到達目標としたマスター遺伝子候補の抽出が終了せず、現在続行中である。本研究ではMED12変異を持つ筋腫、3つのサブタイプのMED12(-)筋腫および正常筋層のそれぞれから各3検体以上のトランスクリプトームデータを得る必要があったが、全検体の回収が同時にはできず何回かに分けてトランスクリプトーム解析を外注したところ、途中で受注業者が変更になり、異なる施設で解析されたサンプルデータが混在する状況になった。そのせいでサンプル間の正規化がうまくいかず、全サンプルデータを同一施設のものに合わせるために受注し直すことになり、予算と時間に大きな損失が出てしまった。しかしながら、結果的にはより信頼度の高いデータを得られたため、今後の解析においてデータのバイアス等の不安が軽減されたことは前向きに評価している。
発現改変細胞株をマウス腎被膜下に移植する異種移植系については、平成30年度中の確立を目指したが達成できなかった。異種移植系についてはこれまでも、免疫不全マウスとしてヌードマウスを用いた検討を行っており、本研究で使用するヒト不死化子宮平滑筋細胞株はヌードマウスには生着できないことが判明している。そこで今回は、重度免疫不全マウスNOD-Scidの使用を検討した。細胞をコラーゲンゲルと混合した細胞凝集塊を作製し、卵巣除去したマウスの腎被膜下に移植し、移植細胞の増殖を促進するためエストロゲンを分泌するビーズを同時に移植した。移植後8週間で凝集塊を移植した腎臓を回収し、腫瘤形成を調べた。その結果、回収した移植腎臓に細胞凝集塊由来の組織片は確認されたが、増殖しておらず、腫瘤を形成していなかった。腫瘤が形成されない理由としては、手技的問題、使用した細胞株の問題およびレシピエントにした重度免疫不全マウスの問題が考えられるので、今後、それぞれについて検証していく。
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| Strategy for Future Research Activity |
Ⅰ. MED12(-)筋腫の各サブタイプに特異的なマスター遺伝子候補の選出：前述したDNAメチロームとトランスクリプトームデータを用いた統合解析により、サブタイプ毎にDNAメチル化変異を伴い発現変化している上流の制御遺伝子を選出する。
Ⅱ. マスター遺伝子候補を単独であるいは複数個同時に発現改変した細胞株の樹立：サブタイプ毎に選出した遺伝子候補が複数ある場合には、単独の遺伝子だけでなく複数の遺伝子を同時に発現改変した細胞株を樹立する。
Ⅲ. 発現改変細胞株をマウス腎被膜下に移植する異種移植系の検討：まず、筋腫細胞あるいは筋腫の組織片をNOD-Scidマウスの腎被膜下へ移植し、腫瘤形成をみることで手技を確認する。次にヒト不死化子宮平滑筋細胞株を用いた細胞凝集塊の移植を検討し、細胞の生着・生存を検証する。NOD-Scidマウスで細胞が生着しない場合、より重度な免疫不全マウスであるNOGマウスの使用を検討する。
Ⅳ. 生体マウスの子宮に遺伝子発現を改変するウイルスベクターを直接感染させる導入系の検討：上記の異種移植系の確立がうまくいかなかった場合、候補遺伝子の発現を改変するレンチウイルスベクターを生体マウス（近交系マウスC57BL/6）の子宮に直接感染させる導入系を検討する。
Ⅴ. 同定したマスター遺伝子の作用機序の検証：マスター遺伝子の下流で発現変化する遺伝子を明らかにし、筋腫発生の分子機構に関する知見を得ることを目的として、トランスクリプトーム解析を行う。同定した各サブタイプ特異的なマスター遺伝子の発現を改変した細胞株とコントロール細胞株を比較して発現変異した遺伝子を抽出する。抽出した遺伝子をパスウェイおよびネットワーク解析に供し，マスター遺伝子の発現変異で影響を受けたシグナル経路および遺伝子群を特定する。
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| Causes of Carryover |
理由：平成30年度に達成予定だったマスター遺伝子候補の選出が出来なかったため、それ以降の遺伝子発現を改変した細胞株の樹立まで実験が進まなかった。そのため、「物品費」の消耗品では、細胞株の樹立に使用するウイルスベクター関連試薬・細胞培養関連および樹立した細胞株の発現確認に使用するウェスタンブロッティング用試薬の代金が使用されずに残った。また、樹立した細胞株のマイクロアレイ解析も行えなかったため、「その他」のマイクロアレイの外注にかかる費用が残った。
使用計画：平成31年度は遺伝子発現を改変した細胞株の樹立を行うため、次年度使用額は上記の消耗品(ウイルスベクター関連試薬・細胞培養関連・ウェスタンブロッティング用試薬）とマイクロアレイの外注に使用する。また、樹立した細胞株の移植実験のため、マウスの購入・飼育費等にも使用する。
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