2020 Fiscal Year Research-status Report
BRCA1遺伝子ミスセンスバリアントのライブラリー作成とがんゲノム医療への応用
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18K09270
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| Research Institution | Tohoku Medical and Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
下平 秀樹 東北医科薬科大学, 医学部, 教授 (70373214)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
工藤 千枝子 東北医科薬科大学, 医学部, 助教 (70816420)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | BRCA1 / PARP阻害薬 / バリアント / がんゲノム医療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
遺伝性乳癌卵巣癌症候群の原因遺伝子であるBRCA1あるいはBRCA2に病的バリアントを有する乳癌や卵巣癌をはじめとする多くの癌でPARP阻害薬が有効である。BRCA1遺伝子のミスセンスバリアントは病的意義が不明なものが多数あるため、それらの機能的評価を行うことはPARP阻害薬の有効性を評価することに直結する。BRCA1遺伝子のミスセンスバリアントを効率的に作成するシステムを構築し、可能な限り多くのバリアントを細胞株に発現しPARP阻害薬への感受性を解析する計画である。出芽酵母を用いたBRCA1 cDNAのミスセンスバリアント作成システムを構築し、現在30種類（データベース上病的バリアントとされているもの25種類、意義不明バリアント(VUS)とされているもの5種類）を作成し、サンガーシークエンスにより確認した。BRCA1欠損細胞株5株(卵巣癌2株：UWB1.289、SNU-251、乳癌3株：HCC1937、MDA-MB-436、UACC-3199)をATCCより購入し、HAタグ付き野生型BRCA1遺伝子を発現するエピゾーマルベクター導入を行った。BRCA1の発現を抗BRCA1抗体及び抗HA抗体で確認したが、細胞によっては発現が不十分なものもあるものの、多くの細胞では概ね良好な発現が確認された。これらに対して、PARP阻害薬としてOlaparibを培養液に投与して2～7日目にMTTアッセイを行った。Olaparibに対するIC50は様々であったが、5µM以下のUWB1.289とMDA-MB-436を以後の解析に使用することとした。両細胞ともBRCA1遺伝子の発現により、OlaparibのIC50は1.5-2.5倍に上昇した。BRCA1遺伝子のバリアント発現では、多くの場合1-2.5倍の間で変動したが、ばらつきが多くデータの確定が難しい状況であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
当初の計画より大変遅れた状況になっている。研究室の器具や試薬はほぼ整備され、日常的に研究可能な体制ではあるが、診療や教育の負担が大きく研究にエフォートが避けない状態が続いている。BRCA１遺伝子のバリアント作成に関しては安定した系が構築され、効率的に目的のバリアントを導入したプラスミドが蓄積されてきている。しかし、現在30種類であり、計画していた種類には遠く及んでいない。培養細胞を用いた検出系としてMTTアッセイを行っている。BRCA1欠損細胞株5株(卵巣癌2株：UWB1.289、SNU-251、乳癌3株：HCC1937、MDA-MB-436、UACC-3199)をATCCより購入し、しかるべき培地で培養している。Olaparibに対するIC50は細胞株によりばらつきがあり、2uMから100uM程度であった。後に野生型BRCA1とバリアントBRCA1を発現した場合の感度を確保するためにはもともと感受性の高い細胞を選択する必要があると考え、IC50が5uM以下の卵巣癌細胞株UWB1.289と乳癌細胞株MDA-MB-436を以後の実験に使用することとした。エピゾーマルベクターによるBRCA1発現により、両細胞においておおむねIC50は1.5-2.5倍になることが判明し、BRCA1バリアントを発現したが、その範囲内で変化はあるものの、全て微小な差異にならざるを得ず、この評価系のみではバリアントの評価が困難であると考えられた。アポトーシスの誘導を検出するシステムなどを試みる必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
基本的な実験を行うための物品はほぼ整い継続的に研究を進める基盤ができたと考えられる。また、医学部4年生が年2人配属されることになっており、教育しつつ研究を進めることが可能となった。現在、BRCA1変異細胞株を使用した実験を行っているが、それらの細胞はBRCA1タンパク質を完全に欠損しているわけではなく、多くは短いタンパク質の断片を発現している。その断片が発現したバリアントの機能に影響を及ぼしていないかを検討するためにCRISPR-Cas9によるノックアウト細胞を樹立して発現することや、バリアントをノックインした細胞を樹立することを行う必要がある。PARP阻害薬に対する影響が、BRCA1以外の因子にも依存している可能性があり、出来るだけ異なる遺伝学的背景の細胞株で基礎実験を行い、最もBRCA1の機能が反映される系を選択する必要がある。BRCA１発現細胞とコントロールベクタ―導入細胞において明らかな差が認められる投与量あるいは解析のタイミングなど至適条件の設定を試みているものの、IC50の差は1.5-2.5倍程度であり、様々なバリアントが全てその範囲内に入るので、評価が困難になっている。アポトーシスの誘導を見るなど検出系の改変を試みる必要がある。
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| Causes of Carryover |
新設医学部であり、研究室の立ち上げに時間と労力を必要とし、本格的に実験を行う体制が整うまでに時間を要したため、次年度使用額が発生した。おおむね実験するための体制は整備されたが、研究に費やす時間がなかなか取れないのが苦しいところである。1期生の学年が上がるたびに教育の負担が増え、予定通りに計画が遂行できていない。本研究は、いったん解析の条件が決まれば、バリアントの検体を増やして、ひたすら解析することになるために、一定のランニングコストが必要になると予測され、今後の期間に集中して研究を推進することで予定金額は有効に活用できると考えている。
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Research Products
(2 results)
