2022 Fiscal Year Research-status Report
BRCA1遺伝子ミスセンスバリアントのライブラリー作成とがんゲノム医療への応用
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18K09270
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| Research Institution | Tohoku Medical and Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
下平 秀樹 東北医科薬科大学, 医学部, 教授 (70373214)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
工藤 千枝子 東北医科薬科大学, 医学部, 助教 (70816420)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | BRCA1 / バリアント |
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| Outline of Annual Research Achievements |
BRCA1およびBRCA2は遺伝性乳癌卵巣癌症候群の原因遺伝子であり、生殖細胞系列の病的バリアントにより乳癌、卵巣癌をはじめ、膵癌や前立腺癌の罹患リスクが上昇する。近年、PARP阻害薬がBRCA1/2遺伝子に病的バリアントを有する上記のいずれにおいても保険診療内で使用可能となり、BRCA1/2遺伝学的検査もコンパニオン診断薬として保険償還されている。従って、BRCA1/2遺伝子のバリアントの臨床的意義を評価することは発がんのリスク評価のためにもPARP阻害薬の効果予測のためにも重要性が高い。本研究はBRCA1遺伝子のミスセンスバリアントを効率的に作成するシステムを構築し、可能な限り多くのバリアントを細胞株に発現しPARP阻害薬への感受性を解析する計画である。現在までにBRCA1のバリアント作成システムは概ね運用可能となり、現在までの45種類のバリアントを作成した。細胞株をいくつか試し、発現の状態などから卵巣癌細胞株のUWB1.289が最も扱いやすく、さらにATCCよりUWB1.289＋BRCA1を追加で購入し、ポジティブコントロールとして条件設定を行った。プラスミド導入からPARP阻害薬投与までの時間は48時間、PARP阻害薬投与から細胞増殖抑制の評価までの時間は5日間が適当であると判断し、バリアントに関するデータを蓄積している。バリアントを試した時に注目すべき違いが検出できるように調整が必要である。BRCA1の機能低下がタンパク量の低下によるものか機能喪失によるものかを分類するために発現量を評価する必要がある。バリアントの数が当初の予定より少ないために、ウェスタンブロッティングで評価を進めている。UWB1.289はp53バリアントを有する細胞株であり、可能であればp53野生型の細胞株でも試すことを考えたいが、今のところできていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
細胞株にBRCA1のcDNAを組み込んだエピゾーマルベクターをリポフェクションにより導入し、発現をウェスタンブロッティングにより確認する段階で、なかなか明確なバンドが得られず、条件設定に苦労した。抗BRCA1抗体での検出が困難であったため、当面HA-tagのあるBRCA1 cDNAを発現し、抗HA抗体で検出することとした。これまで、卵巣癌、乳癌の細胞株を購入し、野生型BRCA1あるいは1塩基置換を有するバリアントBRCA1遺伝子の発現実験を試みてきたが、結果が安定しない状況があるために発現の良い細胞株を選択して、実験を継続する方針とした。BRCA1欠損卵巣癌細胞株UWB1.289細胞およびBRCA1を安定発現したUWB1.289＋BRCA1を購入した。UWB1.289＋BRCA1はポジティブコントロールとして使用できており、データは蓄積しつつある。
研究はやや遅れ気味である。コロナ禍、仙台に複数回起こった地震、臨床業務の負担などが、遅延の原因である。
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| Strategy for Future Research Activity |
BRCA1遺伝子バリアントの種類を可能な限り増やしつつ、UWB1.289細胞にリポフェクションにより導入し、ウェスタンブロッティングおよびオラパリブ投与後のMTTアッセイを行いデータを蓄積する。明らかに病的バリアントと報告されているものと病的でないバリアントと報告されているものを基準として、カットオフ値を設定し、各バリアントを病的バリアント、非病的の2群、あるいは病的、非病的、中間の3群に分類する。可能であれば、一部のバリアントに関してでも他の細胞株で再現性を確認する。また、他のPARP阻害薬であるニラパリブ、ルカパリブに関しても検討を加え、同様の傾向になるかを検討する。
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| Causes of Carryover |
研究の他に診療、教育にエフォートを取られてしまうため、十分な進捗がなかったことが次年度使用額を生じた原因と考えられる。突然、スタッフがCOVID-19の感染者あるいは濃厚接触者になったことや、病棟内でクラスターが出たことなども原因のひとつである。これまで出来るだけ節約しながらやってきたが、本年度は細胞培養やトランスフェクション、ELISAなど高価なキットが必要な実験もあり、恐らく使用が滞ることはないと考えられる。
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