老化因子p16を標的とした革新的な老化卵子の診断法と質の改善法の開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09275
• Research Institution: International University of Health and Welfare
• Principal Investigator: 佐藤 可野 国際医療福祉大学, 医学部, 助教 (00511073)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河村 和弘 国際医療福祉大学, 医学部, 教授 (10344756)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: p16 / 老化

Outline of Annual Research Achievements

高齢不妊の原因である卵巣機能不全は残存卵胞数の減少と細胞老化による卵子の質の低下からなるが、高齢女性に対する有効な不妊治療法はない。現在のところ、卵子の老化の程度を診断し、良好卵子を選別する方法はない。細胞周期関連因子であるp16は細胞老化により発現が増加し、老化を加速する細胞老化マーカーとして近年注目されている。既存の卵子の質を診断する方法として、受精卵の形態学的な評価法がある。しかし老化卵子では形態学的に良好と診断されても若年良好卵子に比べ妊娠率は遙かに劣るため、形態学的評価は有用ではない。また卵巣体細胞や培養液の包括的なトランスクリプトーム解析、プロテオーム解析も試みられているが、解析費用が高額でかつ結果の取得まで時間がかかるため、臨床応用は難しい。本研究では、p16に標的を絞ることで、定量性のある客観的な方法により、安価で簡便にリアルタイムに卵子の老化を診断できる方法を開発する。その為に以下の計画を予定している。① マウス卵巣におけるp16の局在を同定し、老化による発現変化について明らかにする。② p16の発現量と卵子の質の相関を解析するため、マウスの各卵胞構成細胞でのp16の発現とそれぞれの卵胞から採取した卵子に体外受精を行い、卵子の質を反映する受精率、胚発生率、妊娠率を調べる。③ ヒトの各卵胞の構成細胞および卵胞液のp16の発現量を測定し、得られた卵子の体外受精後の受精率、胚発生率、妊娠率などの臨床成績との関連を調べる。④ 高齢マウスin vitro, in vivo試験、ヒトin vitro 試験により、siRNA、中和抗体により卵巣体細胞のp16機能を抑制し、卵子の質の改善を試みる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画していた実験を問題なく遂行できている。

Strategy for Future Research Activity

当初の予定では、体外受精の治療における採卵の際に、個々の卵胞から得られる卵丘細胞、顆粒膜細胞のp16の発現量を定量的RT-PCRにて測定し、患者年齢との相関を調べることを予定している。さらに、それぞれの卵胞由来の成熟卵子の受精率、胚発生率、着床率、流産率、妊娠率を前方視的に解析し、卵子の質を評価する。着床率、流産率、妊娠率に関して、影響を及ぼす因子をもつ患者は解析から除外する。これらの解析結果からヒトにおける卵子の質が低下するp16発現量の閾値を決定する。細胞のmRNA定量で相関が認められなかった際には、卵胞液中のエクソソーム内のp16を抽出し、ELISA法を用いて定量して卵子の質との相関を調べる。
しかしながらp16の発現が低すぎて測定できない可能性もある。その場合はp16の代わりにその下流因子等の測定を検討する。

Causes of Carryover

2018年度に学内施設の動物施設が始動しておらず動物を用いた実験が全くできなかった。
その繰り越し額が2019年度に持ち越したため一年ずつ使用が遅れている。