2019 Fiscal Year Research-status Report

アレルギー性鼻炎の発症・寛解を制御する末梢血免疫細胞のエピゲノム解析研究

Research Project

Project/Area Number	18K09314
Research Institution	University of Yamanashi
Principal Investigator	櫻井大樹山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (10375636)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	アレルギー性鼻炎 / T細胞 / エピゲノム
Outline of Annual Research Achievements	日本国内において特にスギ花粉症の罹患率の高さと生活の質への影響は大きな問題であり、アレルギー性鼻炎の発症機序や寛解機序を解明することは、予防治療や新たな根治治療法の開発に発展できる可能性がある。アレルギー性鼻炎の病態形成にはTh2細胞を中心とした免疫応答が重要な役割を持つと考えられるが、アレルゲンの感作やアレルギー性鼻炎の発症に至る過程、またアレルゲン免疫療法による寛解においてTh2細胞の役割や、その制御機構はまだ良く分かっていない。内因性や外因性のエピゲノム制御が大きな役割を持つ可能性が示唆されるが、これまでアレルギー性鼻炎患者におけるエピゲノム解析の報告は少ない。本研究はスギ花粉症やダニアレルギー性鼻炎患者の検体を用いて、これまでに明らかでないアレルギー性鼻炎におけるT細胞の遺伝子制御およびエピゲノム制御機構を解明する研究である。これまでの臨床研究から症状変化や治療効果に関連し発現が変動する末梢血リンパ球の候補遺伝子について、千葉大学病院にて実臨床で舌下免疫療法を施行している症例から採血を行い、候補遺伝子の発現をPCRにて検証した。その結果、有効群と無効群で治療開始前後の変動に差がみられ、前回の結果を再現する１つの候補遺伝子を確認した。コードタンパクは酵素分子であり、ELISAによる発現解析を行ったが、血清のタンパクレベルでは効果との関連は明らかではなかった。また上記のスギ舌下免疫療法施行者の採血サンプルを、スギ抗原で刺激したのち、CD4＋T細胞を回収し、刺激前後での遺伝子発現とエピゲノム解析を進めている。さらに治療効果との関連について解析を行う予定である。治療効果と関連がみられている1つの遺伝子についてもエピゲノム解析と合わせて関連を解析していく予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason これまでの臨床研究から治療効果に関連し変動する末梢リンパ球の候補遺伝子について、実臨床でスギ花粉症に対してスギエキスを用いた舌下免疫施行を施行している症例から採血を行い、候補遺伝子の発現をPCRにて検証した。また、登録症例の症状について、症状日記、QOLアンケートから解析を行い、解析した症状スコアから治療の有効性に関して有効群と無効群の選別を行った。PCRの結果、有効群と無効群で治療開始前後の変動に差がみられ、前回の結果を再現する１つの候補遺伝子を確認した。候補遺伝子のコードするタンパクは酵素分子であり、ELISAによる発現解析を行ったが、血清のタンパクレベルでは効果との関連は明らかではなかった。上記のスギ舌下免疫療法施行者の末梢血リンパ球サンプルを、スギ抗原で刺激したのち、CD4＋T細胞を回収し、刺激前後での遺伝子発現とエピゲノム解析を進めている。当初、CD4+T細胞のサブグループを分離し、それぞれにおいて遺伝子発現とエピゲノム解析を行う予定であったが、抗原刺激後の回収細胞数が想定より少なかったため、最初にCD4+T細胞全体での解析（ATAC-Seq、RNA-Seq、メチル化解析）を進め、得られた結果より、少数例でさらにCD4+T細胞サブグループの解析へと進めていく予定である。
Strategy for Future Research Activity	これまでの舌下免疫療法の臨床試験の検体を用いた研究より抽出されたマーカー候補遺伝子について、新たにスギ舌下免疫療法を実臨床で施行した症例より得られたサンプルによる検証研究は予定通り進んでいる。候補遺伝子のコードタンパクについてELISAによる血清発現の検討も進んでいる。エピゲノム解析については、末梢血リンパ球をスギ抗原で刺激し、CD4+T細胞を回収し、エピゲノム解析を行う予定であったが、回収細胞数が想定より少なかったため、解析に必要な細胞数を確保するため抗原量や培養日数の調整を行ってきたため、想定より解析の開始に時間がかかっていた。また、当初、CD4+T細胞のサブグループを分離し、それぞれにおいて遺伝子発現とエピゲノム解析を行う予定であったが、抗原刺激後の回収細胞数が想定より少なかったため、最初にCD4+T細胞全体での解析（ATAC-Seq、RNA-Seq、メチル化解析）を進め、得られた結果より、少数例でさらにCD4+T細胞サブグループの解析へと進めていく予定である。当初の予定より進行が遅れているため、エピゲノム解析と遺伝子解析のために使用を見込んでいた費用について、一部予備実験としてプレリミナリーな検討を進めているが、本実験用には次年度に使用する予定となった。細胞の調整ができ次第、解析に入る予定で現在進めている。
Causes of Carryover	これまでの舌下免疫療法の臨床試験の検体を用いた研究より抽出された候補遺伝子について、新たにスギ舌下免疫療法を施行した症例のサンプルによる検証研究は予定通り進んでいる。候補遺伝子のコードタンパクについてELISAによる血清発現の検討も進んでいる。しかし、エピゲノム解析については、末梢血リンパ球をスギ抗原で刺激し、CD4+T細胞を回収し、エピゲノム解析を行う予定であったが、回収細胞数が想定より少なかったため、解析に必要な細胞数を確保するため抗原量や培養日数の調整を行ってきたため、想定より解析の開始に時間がかかっていた。また、当初、CD4+T細胞のサブグループを分離し、それぞれにおいて遺伝子発現とエピゲノム解析を行う予定であったが、抗原刺激後の回収細胞数が想定より少なかったため、最初にCD4+T細胞全体での解析（ATAC-Seq、RNA-Seq、メチル化解析）を進め、得られた結果より、少数例でさらにCD4+T細胞サブグループの解析へと進めていく予定である。また今年度に教室の異動、コロナウイルスによる実験の制限もあり研究の進捗に影響を受けいてる。当初の予定より進行が遅れているため、エピゲノム解析と遺伝子解析のために使用を見込んでいた費用について、一部予備実験としてプレリミナリーな検討を進めているが、本実験用の費用は次年度に使用する。細胞の調整ができ次第解析に入る予定で現在進めている。