蝸牛・前庭感覚上皮発生機序の解析とヒトiPS細胞を用いた難聴モデル作製への応用

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09318
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 大西 弘恵 京都大学, 医学研究科, 研究員 (50397634)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石川 正昭 京都大学, 医学研究科, 客員研究員 (10813743) ; 中川 隆之 京都大学, 医学研究科, 研究員 (50335270) ; 宮本 達雄 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 准教授 (40452627) ; 山本 典生 京都大学, 医学研究科, 准教授 (70378644) ; 田浦 晶子 藍野大学, 医療保健学部, 教授 (70515345)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: iPS細胞 / 蝸牛 / 前庭 / 内耳オルガノイド

Outline of Annual Research Achievements

難聴研究において難聴発症メカニズムの解析や治療効果を検討するためのヒト蝸牛上皮モデルは大変重要であるがその作製方法はまだ確立されていない。そこで本研究ではヒトiPS細胞から蝸牛感覚上皮細胞を分化誘導する方法を確立するため、蝸牛感覚上皮発生に関わる遺伝子や情報伝達系を調節することにより、遺伝子解析結果を検証するとともに蝸牛型の感覚上皮誘導法を確立する。平成31年度は平成30年度に行うはずだった発生過程の各日齢における内耳各部位の発現解析を行う予定であったが、他の共同研究で内耳の遺伝子発現解析データから蝸牛特異的に発現がみられる遺伝子が複数見つかってきたため、マイクロアレイによる発現解析を見合わせることにし、タンパク質をターゲットとしたマススぺクトロメトリーによる網羅的解析を行うことにした。マイクロアレイの計画と同様の日齢のマウスでレーザーマイクロダイセクション用の凍結切片作成を行い解析待ちである。平成31年度以降に行うはずであった「遺伝子発現解析結果の検証と蝸牛型感覚上皮誘導法の確立」に必要な検証は昨年度始めておりATOH1-GFP hiPSCからの内耳有毛細胞誘導法の安定化を目指した検証を行っている。さらに蝸牛化を検証するため前述の蝸牛特異的発現遺伝子に蛍光タンパク質を融合させたknock-in iPS細胞の作製を目指し、Lipofectamin法によるCas9 vectorとターゲティングベクターの導入条件を検討し、5割以上の細胞への導入に成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成30年度に行うはずのトランスクリプトーム解析は行えていないものの、この解析で見出したい蝸牛特異的遺伝子は申請者が関与した他の共同研究より明らかになり、これらを分化マーカーとしてiPS細胞由来蝸牛誘導のためのマーカー遺伝子-蛍光タンパク質融合タンパク質を発現するiPS細胞の作製準備を進めているため、実質申請書の予定とほぼ変わらないレベルの進捗が得られている。またトランスクリプトーム解析に変わるプロテオーム解析についてもレーザーマイクロダイセクション用のサンプルは準備されており、コロナウイルス禍がなければ解析終了していた可能性が高い。

Strategy for Future Research Activity

I. プロテオーム解析による蝸牛化に関与する因子の選定：他の共同研究で内耳の遺伝子発現解析データから蝸牛特異的に発現がみられる遺伝子が複数見つかってきたため、マイクロアレイによる発現解析を見合わせることにし、タンパク質をターゲットとしたマススぺクトロメトリーによる網羅的解析を行うことにした。発生過程マウス各日齢の内耳凍結切片からマイクロダイセクションにより内耳の各部位を回収してマススぺクトロメトリー解析を行い、各部位の比較から蝸牛化に関与する因子を選定する。
II.　iPS細胞由来内耳前駆細胞を用いた候補遺伝子の検討：蝸牛特異的遺伝子が複数分かってきているので、ヒトiPS細胞由来内耳前駆細胞から内耳有毛細胞誘導過程でそれらの発現がどのようになっているか、また強制発現することによる蝸牛化の可能性について検討する。また分化誘導時の蝸牛化の指標とするべくこれらの遺伝子とGFPなどを融合させたタンパク質を発現するiPS細胞をゲノム編集技術を用いて作成する。前駆細胞への遺伝子導入にはAAVの利用も検討する。
III. iPS細胞由来内耳前駆細胞を用いた蝸牛誘導因子の検討：I.の解析で選定された蝸牛化関連因子をiPS細胞からの内耳分化誘導過程で添加し、蝸牛化への可能性について検討する。

Causes of Carryover

「蝸牛感覚上皮発生に特有な遺伝子の同定」のため耳包形成から有毛細胞形成までの各日齢の周辺組織を含むマウス内耳組織切片を作成し、前庭・蝸牛の各部位をレーザーマイクロダイセクション等によって回収しマイクロアレイによる発現解析を行う予定であったが、共同研究者との発現解析から蝸牛特異的遺伝子が複数明らかとなったため、同じような解析を行うより、同じ凍結切片からタンパク質レベルの解析を行うこととしマススぺクトロメトリーによるプロテオーム解析を行う予定である。よって今年度使用しなかったマイクロアレイ解析に関する予算が残っているが、コロナウイルス感染対策による研究規制が解除され次第プロテオーム解析に用いる予定である。