2019 Fiscal Year Research-status Report
Construction of a mouse model for Auditory Neuropathy Spectrum Disorder
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18K09365
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
難波 一徳 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 共同研究員 (60425684)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤岡 正人 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (70398626)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | オーディトリーニューロパチー / ANSD / OTOF / オトフェリン / DPOAE / アポトーシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
OtoferlinはOtof遺伝子(Otof)の遺伝子産物で、有毛細胞のリボンシナプスに発現し、聴神経の伝導のためのシナプス小胞の分泌およびリサイクルに責任がある。このOtofがノックアウトされたマウスは、外有毛細胞の機能(音響放射, DPOAE)は正常であるが、聴覚神経の活動(聴性脳幹反応, ABR)が観られない感音性難聴であるオーディトリーニューロパチー (ANSD)の特徴を示す。申請者は、Otof欠損マウスのラセン神経節においてラセン神経節細胞(SGN)が減少し、それはBDNFの減少を伴う細胞死（アポトーシス）によることを世界に先駆けて発見した(2012-2014年度_若手B, 研究課題番号27491819による)。
本研究では、このOtof欠損マウスを用いて、発達段階において、DPOAEおよびABRの測定を行い、同時にSGNの免疫組織学的解析を行う。免疫組織解析では、主にBDNFの発現パターンを調べることとする。また、Otof欠損マウスにBDNF等の神経栄養因子を注入することにより、アポトーシス回避によるレスキュー実験を行い、正常なSGNの状態に戻すことを最終的な研究目的とする。この治療の確立により、人工内耳などのインプラント技術を用いた際の生体のメンテナンス機能を向上することが可能となる。
現段階では一度凍結されたOtof遺伝子ノックアウトマウス(C57B6N系統)の受精卵を用いて、本マウスのライブコロニーの再度立ち上げを進めている。マウスライブコロニーが納入された際に実験および解析を行うための、小動物DPOAE、およびABRの聴力測定装置、蛍光顕微鏡などの準備は完了している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本遺伝子改変マウスはUCDavisとの協力により、受精卵からのライブコロニー作成を進めてており、既にライブコロニーの作成は完了している。現在、Otof遺伝子欠損マウスのヘテロ遺伝子型の雄と雌のそれぞれのマウスの継代、維持を行っている。本マウスは、3月下旬に本慶應大学医学部動物実験センターに納入予定であったが、現在COVID-19パンデミックの影響により、搬出先のUCDavisと本慶應大学医学部の実験動物の搬出、搬入が凍結となり、ペンディングの状態であることが理由である。
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| Strategy for Future Research Activity |
COVID-19の影響における本大学での実験動物納入の凍結が解除された後には以下の実験を開始するものとする。
前段階の研究においてC57/B6NをバックグラウンドとするOtofマウスを用いたが、そのバックグラウンドに合わせてデータを取る必要性を考慮した。しかしC57/B6マウスはCDH23遺伝子に変異があり、老齢に伴う進行性難聴を呈する。生後6か月以降のC57/B6Nでは、顕著な有 毛細胞の減少が観られるため、その時期のSGNに着目したANSDの病態解析に影響してしまう。 そこで、CDH23の変異をゲノム編集により正常に戻した、同バックグラウンドのCDH23-ahlマウスを総合医学研究所の吉川博士よりお譲り頂き、これを用いて交配させ、Otof遺伝子の影響のみに帰属できる遺伝子型のマウスの交配、作成を行う。これによりANSDの病態を老化に影響なく解析することができると考えられる。
今後の予定として、Otof遺伝子がノックアウトされたCDH23-ahlマウスを作成し、それぞれの発達段階での小動物用ABRおよび DPOAE装置の測定を行うこととする。 同時に、聴力測定した同マウスのらせん神経節の免疫組織染色(BDNF)データの作成、および分析を行うものとする。これらのデータを解析することにより、ANSDの病態の詳細が分子レベルにより明らかになることが期待される。
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| Causes of Carryover |
本研究に用いるOtof遺伝子欠損マウスは、受精卵での保存状態にあったため、当初は受精卵の輸入手続きを進めていた。しかし、本学の動物搬入受け入れのためのSPF基準など、クリアすべき項目を満たす必要があり、ライブコロニーに立ち上げてから本国に輸入するという手続きに切り替え進めるという経緯があった。また、保存されていた受精卵は個数が比較的少なかったということから、ライブコロニーが立ち上がるまで大きく時間が掛かってしまった。以上、これらの手続きにより支払いが遅れたことから次年度使用額が生じた一つの理由である。
また、COVID-19パンデミックにより、協力研究機関であるUCDavisの搬出禁止、および慶應大学医学部動物実験センターの実験動物搬入禁止が発令され、昨年度依頼した実験動物のための研究費の支払いが年度内にできなかったことが次年度使用額が生じたもう一つの理由である。
使用計画は、現在作成した実験動物とその継代維持費(UCDavis)、ワールドクーリア社に依頼済みの輸送費用に使用することに加え、動物飼料、免疫組織学実験に用いる抗体試薬など組織実験のための各試薬類、実験装置類の消耗品等に使用する予定である。また、本研究で得られると考えられる研究成果は学会で発表を行い、また論文執筆のための費用に充てるものとする。
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