Construction of a mouse model for Auditory Neuropathy Spectrum Disorder

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09365
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 難波 一徳 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 共同研究員 (60425684)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤岡 正人 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (70398626)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: Otof / Otoferlin / オトフェリン / オーディトリーニューロパチー / ANSD / ラセン神経節細胞 / SGN / 遺伝子改変マウス

Outline of Annual Research Achievements

OtoferlinはOtof遺伝子(Otof)の遺伝子産物で、有毛細胞のリボンシナプスに発現し、聴神経の伝導のためのシナプス小胞の分泌およびリサイクルに責任がある。このOtofがノックアウトされたマウスは、外有毛細胞の機能(音響放射, DPOAE)は正常であるが、聴覚神経の活動(聴性脳幹反応, ABR)が観られない感音性難聴であるオーディトリーニューロパチー (ANSD)の特徴を示す。申請者は、Otof欠損マウスのラセン神経節においてラセン神経節細胞(SGN)が減少し、それはBDNFの減少を伴う細胞死（アポトーシス）によることを世界に先駆けて発見した(2012-2014年度_若手B, 研究課題番号27491819による)。

本研究では、このOtof欠損マウスを用いて、発達段階において、DPOAEおよびABRの測定を行い、同時にSGNの免疫組織学的解析を行う。免疫組織解析では、主にBDNFの発現パターンを調べることとする。また、Otof欠損マウスにBDNF等の神経栄養因子を注入することにより、アポトーシス回避によるSGN生存を目的とするレスキュー実験を行うことで、正常なSGNの機能に戻すことを最終的な研究目的とする。この治療の確立により、人工内耳などのインプラント技術を用いた際の生体のメンテナンス機能を向上することが可能となる。

現段階では一度凍結されたOtof遺伝子ノックアウトマウス(C57B6N系統)の受精卵を用いて、本マウスのライブコロニーの立ち上げに成功し、本研究施設への納入手続きが完了した。現在、Otof遺伝子欠損マウスのヘテロ遺伝子型(+/-)の交配および継代により、Otof遺伝子欠損マウスのホモ個体(-/-)を得ることに成功している。
また、実験および解析を行うための、小動物DPOAE、およびABRの聴力測定装置の実用化段階までの整備に成功している

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本遺伝子改変マウスは、昨年度UCDavisとの協力により、受精卵からのライブコロニー作成が完了した。昨年より拡大したCOVID-19パンデミックの影響により、搬出先のUCDavisと本慶應大学医学部の実験動物の搬出、搬入が凍結となり、両国の規制により納入不可の状況に追い込まれ、現状待機を強いられた状況となった。
しかし、未定であった米国と本国のそれぞれの規制が解除される運びとなり、SPFもクリアし無事納入が完了した。

パンデミックによる世界中の動物輸入規制が大変厳しくなっている状況下で、本遺伝子改変マウスが本研究室に納品できたことは、極めて幸運であった。また、納入されたヘテロ遺伝子型マウスの健康状態、生殖能力に問題なく、現在、Otof遺伝子欠損マウスのヘテロ遺伝子型の雄と雌のそれぞれのマウスの継代、維持に成功し、ホモ遺伝子型の個体も得ることに成功し、論文情報と同じ表現型の難聴タイプを示すのを確認した。

現在、本研究室に設置されている小動物専用の聴性脳幹反応(ABR)および、耳音響放射(DPOAE)の整備が完了しており、深麻酔下における測定において、実際の測定領域に準じたシグナルが得られており、実験基盤が整いつつある。COVID-19パンデミックの強い規制下において、現段階の実験基盤まで進められたことは、本研究はおおむね順調に進展していると言える。

Strategy for Future Research Activity

ホモ遺伝子型(-/-)マウスの減少したSGNを、BDNF等の神経栄養因子を注入することにより正常なSGNの状態に戻すこと、つまりアポトーシス回避によるレスキュー実験を行うことを最終的な目的とする。そのSGNのレスキューを定量する目的として、次の2つの実験を並行して行うこととする。
１）野生型(+/+)、ヘテロ遺伝子型(+/-)、ホモ遺伝子型(-/-)のそれぞれSGNの1型および2型神経細胞のアポトーシスによるSGNの減少を、免疫組織染色による蛍光イメージングを行う。この解析により、Otof遺伝子型によるSGNの減少パターンの差異が明らかになると考えられる。
２）上記遺伝子型のマウスの特定の時期でのABRおよびDPOAEの測定を行う。
３）BDNFなどの神経栄養因子を投与した上記遺伝子型のABRおよびDPOAEの測定を行う。

Causes of Carryover

本研究における遺伝子改変マウスは、米国UC-Davisにて、ライブコロニー化および輸入する必要があったことは前に述べたが、Covid-19パンデミックの影響により、米国での輸出の規制、本国の緊急事態宣言による凍結により、当初の研究予定から大幅に搬出および納入に遅れが生じたことが理由である。
また、本遺伝子改変マウスを飼育している現動物センターもパンデミックの中、厳重な運用状況下で稼働しており、本実験計画は規制環境下で慎重に遂行する必要がある。
また、実験に使用する数種類の抗体試薬においても、以前に比べて高いSPFレベルが要求されており、輸入にも多くの時間が掛る状況である。本研究は、遺伝子型をまたいで、マウスの実験個体数が要求されるものであり、現Covid-19パンデミックの状況では、不可能であった。
パンデミック影響による多くの規制はやむを得ないが、大きな損失あるいは問題が生じないよう、実験規制に従い本研究を遂行すべく、研究費を使用するものとする。また、試薬においては、比較的保存がきくもの、また測定装置の維持などに優先的に研究費を使用することで、柔軟に本研究を遂行していく予定でいる。