ヒト小児咽頭扁桃における粘膜免疫誘導メカニズムの解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09381
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 小笠原 徳子 札幌医科大学, 医学部, 講師 (00438061)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 聡 札幌医科大学, 医学部, 助教 (10588479) ; 佐藤 豊孝 札幌医科大学, 医学部, 講師 (30756474)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 咽頭扁桃上皮細胞 / M細胞

Outline of Annual Research Achievements

小児期に最も発達を示す鼻咽腔粘膜関連リンパ組織(NALT)の構成成分であるヒト咽頭扁桃組織を用いて，ヒトNALTの機能解析を行うことを目的とした。2019年度は
手術で得られた小児咽頭扁桃上皮細胞の初代培養を行い、それらを用いて、ダブルチャンバーでの気液界面細胞培養系(Air-Liquid Interface: ALI)による気道上皮細胞の機能に関する予備検討を行なった。具体的には、RSウイルスやライのウイルスなどの呼吸器感染性ウイルス感染によるサイトカイン産生能力の誘導とサイトカイン産生誘導の阻害効果を持つ薬剤の気道上皮細胞における作用点の解析を行い、また肺炎球菌などの混合感染における上皮バリア機能や肺炎球菌の潜り込みについて、気道上皮細胞の果たす自然免疫の機能解析を行った。さらにフローサイトメトリ による
cell sortingを行うための細胞接着剥離に関する予備検討を小児咽頭扁桃上皮細胞を用いて行い、接着細胞剥離に使用できかつ細胞表面抗原の活性や発現を損なわない条件・薬剤を各種検討した。
また初代小児咽頭扁桃上皮細胞にAPCをconjugateしたOVAを処理し、取り込みをさせて、細胞内に取り込まれたOVAを細胞膜をpermeabilizeし、フローサイトメトリ ーでAPC陽性細胞をセルソーティングできるかどうか検討を行った。
またALIとsubmergeの細胞でウイルス感染時にバリア機能がどのように変化するか測定し、submergeとALIの状態ではRSウイルス感染時のバリア機能の変化が異なることを見出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

sortingの条件検討に入ることができ、初代小児咽頭扁桃上皮細胞の培養も順調に進んでいるため

Strategy for Future Research Activity

気道上皮細胞株および小児咽頭扁桃上皮培養細胞を用いて、APCを取り込む細胞と取り込まない細胞をセルソーティングで選別して回収し、RNA sequenceを行い、遺伝子発現を比較検討する。またそれらの遺伝子発現変化の結果をreal-time PCR・免疫化学染色で確認し、小児咽頭扁桃上皮細胞におけるM細胞のマーカーとなりうるタンパク質を確定する。

Causes of Carryover

RNA シークエンスに外注する際にサンプルを一度に提出する必要があるため本年度は解析を委託しなかったため次年度使用額が生じている。
最終年度に本年度のサンプルと合わせて8サンプル程度を外部委託のRNA シークエンスに出すことを計画している。