ゲノム編集を用いた新規的内耳遺伝子導入法の開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09383
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 坂口 博史 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 研究員 (00515223)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 瀧 正勝 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30453111) ; 上山 健彦 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 准教授 (80346254)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 内耳 / 遺伝子 / 難聴

Outline of Annual Research Achievements

感音難聴は人口比5%に達する頻度の高い疾患でありながら、未だ根治的な治療はなく、その克服にむけた新規治療法の開発に期待が寄せられている。特に感音難聴の成因としては内耳性難聴が多く、本研究では遺伝子導入や分子標的治療を含む内耳病変に対する新しい治療的アプローチを検証している。昨年度までの研究により、マウス胎児における遺伝子導入の手技および効率についてエレクトロポレーション法を用いた手法により検証し、内耳細胞において一定の遺伝子発現を確認することができた。また、ゲノム編集による遺伝子治療のターゲッ トとなる感音難聴に関して、本邦で同定された遺伝子点変異による遺伝性難聴を候補として、モデルマウスを用いてその病態ならびに遺伝子発現に関する解析を 行なっている。候補遺伝子はヒト遺伝性難聴の原因遺伝子であり、細胞内アクチン制御に関わっていることが知られている。同分子の局在を免疫組織化学法を用いて調べたところ、不動毛ならびに細胞間結合に集積することが判明している。今年度は同分子のノックインマウスモデルを作成し、そのマウスにおける内耳のフェノタイプを解析している。同マウスにおいては生理的条件下では難聴を呈さないが、音響暴露などのストレス負荷時に特に高音域での難聴を呈することが判明しつつある。このような後天的難聴は、騒音性難聴、老人性難聴、薬剤性難聴など種々のヒトでみられる感音難聴のモデルになり得ると考えられ、遺伝子治療の有効性を検証する上で有用なツールとなり得る。これまでの解析で、同モデルマウスにおいては有毛細胞のシナプス障害が有毛細胞自体の障害に先じて生じることが判明してきているため、治療のターゲットとなる細胞を蝸牛神経節細胞と考えて、実際の遺伝子治療に必要となるコンストラクトおよび導入方法の検証を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

内耳は解剖学的にアプローチが難しい臓器であり、ゲノム編集を用いた遺伝子治療を実現する上では、内耳への遺伝子導入技術の確立が必須となる。特に本研究においてはエレクトロポレーションによる生体内への遺伝子導入を主な手法として検討している。内耳への遺伝子導入手法は一般には確立されておらず、胎生致死などを避けて十分な遺伝子発現量を得るという点で技術的に難しい面も多い。しかしながら、これまでの研究において胎児への投与時期、投与の条件、刺激条件などを改善し、結果として胎生致死の確率を大幅に減少して、生後マウスにお ける導入遺伝子の発現を十分に観察しうるだけの実験系が確立された。しかしながら、本研究で当初目指していた感覚上皮細胞への遺伝子導入は非感覚上皮細胞に比べて導入効率が低く、現時点では感覚上皮細胞における発現効率は約5%程度であり、治療に有効となる発現効率を得ることは未だ困難と考えられる。一方で、内耳性難聴には感覚上皮障害のみならず、神経節細胞や感覚上皮以外の上皮細胞が関与する疾患も知られており、これらの細胞ではより効率的に遺伝子導入が行える可能性がある。そのため、現在は研究対象として神経節細胞が障害される遺伝性難聴モデル動物を用いて、遺伝子治療の可能性を改めて検討している。本モデルを研究ツールとして用いる上で、内耳および聴覚のフェノタイプ解析は順調に進んでおり、これまでのところ後天的なシナプス障害を中心とする難聴が発症することが明らかになってきた。また、同モデルマウスにおいては、内耳のみならず骨髄細胞においても表現型が出ると予想されており、今後は内耳と比べて遺伝子導入や表現型解析が容易な骨髄細胞に対しても実験系を拡大することができるため、遺伝子導入の検証が容易となり、研究をさらに加速できると考えている。

Strategy for Future Research Activity

現在は、新たな治療ターゲットとなるモデルマウスのフェノタイプ解析をとりまとめて、障害の程度や治療戦略を検討している。本モデルマウスでは遺伝子点変異が原因の先天性内耳障害があるものの、フェノタイプとしては後天性難聴を生じるため、胎生期の耳胞に遺伝子導入する必要がなく、生後の内耳に遺伝子導入を行うことで障害から回復できると期待される。この際に、障害部位である蝸牛神経節細胞で遺伝子発現を得る必要があるため、内耳窓経由、前庭経由などいくつかの遺伝子投与ルートを解剖学的見地から検討している。実際の投与に先立って、これらの薬剤投与手技による内耳障害の有無について模擬手術とABR等を用いて確認する予定である。また、ターゲットとなる点変異の修復に必要となるプラスミドコンストラクトの作成や、標的配列切断用のCRISPR/Cas9コンストラクト、HDR用またはNHEJ用の2種類のドナーDNAコンストラクト、正常配列を含む2種のドナーDNAコンストラクトなどの設計についても並行して進める予定である。さらに、ゲノム編集効率などの確認には、手技的に難しい生体内耳での実験に先立って、骨髄系細胞を抽出して利用することも検討している。これらの検証の後に、内耳への遺伝子導入を行い、発現効率と治療効果を検証する予定である。導入効率と治療効果判定のための手法は、すでに昨年までに確立しており、正常状態でのデータも集積されている。これまでに確立した手技を用いて、電気生理学的解析と組織学的解析を組み合わせて行う予定である。また、本モデルでは音響暴露により難聴を誘発することができるため、遺伝子や薬剤を投与するタイミングを検討することでより効率的な治療効果が得られる可能性もある。内耳障害が発症する前後のいくつかの時期に遺伝子導入を行い、治療効果の判定を行う。

Causes of Carryover

当初の計画においては、本年度にモデルマウスを用いた遺伝子導入を検証する予定であり、そのため多数の実験動物や多量の分子生物学的試薬の購入を見込んでいた。しかしながら、当初予定していたモデルマウスを用いると、感覚上皮細胞への遺伝子導入は非感覚上皮細胞に比べて導入効率が低かったため、研究の遅延をきたす可能性が危惧された。そのため、遺伝子導入の候補として新たなモデルマウスについて検証を行い、今年度はそのフェノタイプ解析を中心とした研究を行った。結果として同モデルマウスは本研究においてより良好な対象であることが判明したが、今年度においては分子生物学的な試薬等の必要量が少なかったため、次年度以降に購入する予定に変更した。