2019 Fiscal Year Research-status Report

網膜疾患関連遺伝子の機能解析のための新規CRISPR-Cas9ベクターの開発

Research Project

Project/Area Number	18K09395
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	藤田幸輔東北大学, 医学系研究科, 助教 (80708115)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中澤徹東北大学, 医学系研究科, 教授 (30361075) 西口康二東北大学, 医学系研究科, 准教授 (30447825)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	アデノ随伴ウイルス / ゲノム編集 / 網膜 / 遺伝子治療
Outline of Annual Research Achievements	近年、遺伝子解析技術の発展により眼疾患の遺伝的背景が急速に解明されつつある。しかし、同定された多くの疾患関連遺伝子の機能解析が十分になされていない。一方、近年、効率的な遺伝子機能解析手法としてCRISPR-Cas9システムによるゲノム編集が注目されている。これを用いて短時間かつin vivoで網膜神経細胞における遺伝子機能を評価する場合、アデノ随伴ウイルス（AAV）を用いてターゲット細胞にシステムを導入することになるが、AAVは搭載可能なインサートサイズが小さいという難点がある。本研究は、CRISPR-Cas9システムによるゲノム編集に必要な各パーツを小型化することにより１つのAAV上に搭載したAll-in-one AAVベクターを作製し、網膜細胞を対象に効率的な遺伝子機能解析を可能にする技術開発を目的とする。初年度は、視細胞特異的な小型プロモーターを開発し、それを組み込んだAll-in-oneゲノム編集用AAVを作製した。ゲノム編集を効果的に判定するために、視細胞変性モデルマウスを用いて、ゲノム編集による病因変異の正常化とそれによる治療効果を検討した。当該年度は、引き続きゲノム編集による治療効果を詳細に解析・検討した。その結果、開発したAll-in-one ゲノム編集AAVベクターにより、マウス視細胞の病因変異がおよそ10%正常に修復されたことを明らかにした。その効果について組織学的、電気生理学的、行動学的に視機能を評価したところ、従来の遺伝子治療と同程度にまで視力が回復したことが示された。加えて、オフターゲット効果が生じていないことも確認し、有用な遺伝子治療ツールとなりうることを示した。本研究は効率的な遺伝子機能解析の大幅な効率化とともに、遺伝子治療への応用も期待できるものである。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当該年度はAll-in-one AAVベクターの作製を行い、年度後半からマウス網膜でのゲノム編集効果の評価に取り組む計画であった。現在までのところ、開発したAll-in-one AAVベクターを用いて視細胞のゲノム編集による遺伝子治療を行い、視機能回復に成功した。以上のように、既に遺伝子治療まで可能なAll-in-one AAVベクターが完成している。これは遺伝子機能解析にも有用である。現段階において、研究を進める上で大きな問題はなく、おおむね順調に進展していると評価した。
Strategy for Future Research Activity	今後はゲノム編集効率の向上に取り組み、より効果的なゲノム編集ツールの開発を行っていく。ゲノム編集効率の向上が見込まれる薬剤の検討や、AAVベクターの改変を行い、培養細胞を用いた系により評価する。選定した改良型AAVベクターをマウス網膜に導入し、編集効果を解析していく。また、網膜の他の細胞種を標的にしたゲノム編集ＡＡＶベクターの開発も同時に行っていく。
Causes of Carryover	（理由）ＡＡＶ作製には多量のプラスミド作製・培養関係の消耗品、また精製過程にはカラムや溶液、濃縮用のカラムも必要であり、クオリティチェックにもSDS-PAGE、ウイルスゲノムの定量、遺伝子発現解析を行う必要があり、関連試薬費として計上した。しかし、当該年度はＡＡＶベクターが開発済だったこともあり、ＡＡＶの消費が想定より若干少なかったため、次年度に繰り越す結果となった。（使用計画）ゲノム編集ＡＡＶベクターの改良を行う予定であり、多量のプラスミド作製・培養関係の消耗品、また精製過程にはカラムや溶液、濃縮用のカラムも必要であり、クオリティチェックにもSDS-PAGE、ウイルスゲノムの定量、遺伝子発現解析を行う必要がある。また、使用するマウスについても費用を要する。