Development of a novel CRISPR-Cas9 vector for functional analysis of retinal disease-related genes

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K09395
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 藤田 幸輔 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (80708115)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中澤 徹 東北大学, 医学系研究科, 教授 (30361075) ; 西口 康二 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (30447825)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: アデノ随伴ウイルス / ゲノム編集 / 網膜 / 遺伝子治療

Outline of Annual Research Achievements

近年、遺伝子解析技術の発展により眼疾患の遺伝的背景が急速に解明されつつある。しかし、同定された多くの疾患関連遺伝子の機能解析が十分になされていない。一方、近年、効率的な遺伝子機能解析手法としてCRISPR-Cas9システムによるゲノム編集が注目されている。これを用いて短時間かつin vivoで網膜神経細胞における遺伝子機能を評価する場合、アデノ随伴ウイルス（AAV）を用いてターゲット細胞にシステムを導入することになるが、AAVは搭載可能なインサートサイズが小さいという難点がある。本研究は、CRISPR-Cas9システムによるゲノム編集に必要な各パーツを小型化することにより１つのAAV上に搭載したAll-in-one AAVベクターを作製し、網膜細胞を対象に効率的な遺伝子機能解析を可能にする技術開発を目的とする。
前年度までに、視細胞特異的な小型プロモーターを開発し、それを組み込んだAll-in-oneゲノム編集用AAVを作製した。ゲノム編集を効果的に判定するために、視細胞変性モデルマウスを用いて、ゲノム編集による病因変異の正常化とそれによる治療効果を検討した。 その結果、開発したAll-in-oneゲノム編集AAVベクターにより、マウス視細胞の病因変異がおよそ10%正常に修復されたことを明らかにした。その効果について組織学的、電気生理学的、行動学的に視機能を評価したところ、従来の遺伝子治療と 同程度にまで視力が回復したことが示された。加えて、オフターゲット効果が生じていないことも確認し、有用な遺伝子治療ツールとなりうることを示した。 当該年度は、引き続き臨床応用に向けて編集効率の向上に取り組むとともに、他の網膜細胞編集用ベクターの開発も行った。
本研究は効率的な遺伝子機能解析の大幅な効率化とともに、遺伝子治療への応用も期待できるものである。