２光子励起顕微鏡を用いた網膜および視神経疾患における眼球深部動態観察

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09408
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 臼井 審一 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (20546882)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松下 賢治 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (40437405)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 2光子励起顕微鏡 / アストロサイト / 網膜 / 緑内障 / 視神経

Outline of Annual Research Achievements

多光子励起顕微鏡を用いて、マウスの眼球深部組織の生体観察を行うことを目的とし、まず、野生型マウスを用い、尾静脈から注入する薬剤の投与法について網膜伸展標本を作成して条件検討を行った。次に、多光子励起顕微鏡を用いて実際に視神経の生体観察を行うため、マウスの視神経を露出させるための手法を固定台も含めて検討した。マウス網膜および視神経の生体観察のための条件検討として、野生型マウスを用いた。使用薬剤は、核染色を行うためのHoechst3334、血管染色ためのQtracker655もしくはrhodamine dextran（60kD以上）、アストロサイトのマーカーとしてsulforhodamine101を主に用いた。最初に、若齢マウスを用いて週齢によって体重あたりに全身投与できる薬剤の量を確認した。まず、自家加工を施した30G針を用いて尾静脈より血管を確保し、目的の薬剤を順次投与した。検討項目は、（１）各薬剤が単独で染色される時間と投与量との関係、（２）複数の薬剤をそれぞれ時間差で投与し多重染色を行うための投与量と時間配分、（３）複数の薬剤を混合して投与する場合の各薬剤の投与量で、それぞれ条件を振りながら一つ一つ確認して最適な投与法を現在も検討中である。また、アストロサイトの観察には、GFAP-eGFPトランスジェニックマウスも用いて、sulforhodamine101による染色像と比較する予定であるが、動物舎内の感染汚染のため、GFAP-eGFPトランスジェニックマウスはしばらく使用できなくなり、改めて熊本大学生命資源研究・支援センター動物資源開発研究部門より凍結胚を購入し、系統を維持を再開した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

おおむね順調であるが、動物舎で感染症が２度にわたり発生したため長期間マウスの飼育が不可能となった。そのため、GFAP-eGFPマウスを維持することが出来なくなり、支障を来した。

Strategy for Future Research Activity

GFAP-eGFPマウスが使用できるようになるまでは、野生型マウスを用いて生体観察可能な条件を検討し、２光子励起顕微鏡を用いて観察する。２光子励起顕微鏡を用いた眼球深部観察の系の確立にはもう少し時間を要するものと予想される。

Causes of Carryover

動物舎が感染で汚染され長期間使用不可能となったため、実験中止を余儀なくされたため。今年度は、可能な実験からスタートする。