糖尿病網膜症モデルラットの網膜微小血管内皮細胞におけるタイト結合蛋白の発現と機能

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09415
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 稲富 周一郎 札幌医科大学, 医学部, 講師 (10437999)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大黒 浩 札幌医科大学, 医学部, 教授 (30203748) ; 日景 史人 札幌医科大学, 医学部, 助教 (30837547)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 血管内皮細胞 / タイト結合 / 糖尿病網膜症

Outline of Annual Research Achievements

糖尿病モデルラットから初代微小脳血管内皮細胞を分離・培養し、その内皮細胞バリア機能を制御するタイト結合関連分子の発現と局在などの形態とそのバリア機能（透過性または抵抗）を検討し、糖尿病網膜症における微小血管内皮細胞の機能異常を分子レベルで解明することが本件急の目的である。これまで糖尿病モデルラットであるSpontaneously Diabetic Torii (SDT) ラットの脳から微小脳血管内皮細胞の初代分離培養に成功し、細胞間接着分子であるoccludinとclaudin-5（Cld-5)の発現と局在をウエスタンブロット法と免疫染色にて確認した。OccudinとCld-5はco-localizeしておりその局在はタイト結合にあることが確認された。Cld-5は血管内皮細胞に特異的に発現するタイト結合関連蛋白であり細胞間隙のバリア機能を制御することが知られている。初代培養した正常ラットの微小血管内皮細胞とSDTラットの微小血管内皮細胞のタイト結合関連蛋白の発現をRT-PCRとウエスタンブロット法で検討中である。現在、Grial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF)がVasucular Endothelial Growth Factor（VEGF)を介してタイト結合関連蛋白の発現に与える影響を検討中である。同時にCld-5の発現が微小血管内皮細胞間バリア機能に与える効果を検討するため経上皮電気抵抗値TEERを測定しているところである。正常ラットと糖尿病モデルラットの初代微小血管内皮細胞間のTEER値に優位さは認めないが今後はGDNFおよびVEGF添加下での検討を要する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

現時点で糖尿病モデルラットであるSDTラットの脳から血管内皮細胞の初代培養に成功し、その細胞接着蛋白の発現と局在を確認できているためおおむね予定通りに進行している。一方でGDNFがその細胞接着分子に対する影響については明らかな優位さと再現性がえられていないためおおむね順調な進展とした。

Strategy for Future Research Activity

今後の推進方策はGDNFがVEGFを介してタイト結合関連蛋白の発現に与える影響を検討すると同時にCld-5の発現が微小血管内皮細胞間バリア機能に与える効果を検討するため経上皮電気抵抗値TEERを測定を継続し、またラジオアイソトープで標識された分子量の異なるMannnitolとInulinの透過性を調べることで、実際にGDNFが糖尿病ラットの微小血管内皮細胞間のバリア機能に及ぼす影響を検討する予定である。

Causes of Carryover

これまでの実験は過去に当科にて施行してきた「正常ラットの脳微小血管細胞の初代培養の確立」と「糖尿病網膜症においてVEGFが血管新生に関与するとともに血管バリア機能を低下させる」研究に使用していた機材を利用できるとともに各種培養液、抗体がすでにそろっていたため当該当年度の実支出額が低値であった。今後は更なる培養機材、培養液、抗体等が必要となるため次年度は翌年分の請求額に合わせた予算を要する。