水素ガス吸入による網膜虚血再灌流障害抑制効果の検討

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09442
• Research Institution: University of Toyama
• Principal Investigator: 林 篤志 富山大学, 学術研究部医学系, 教授 (20283773)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柚木 達也 富山大学, 学術研究部医学系, 講師 (30401805) ; 宮腰 晃央 富山大学, 学術研究部医学系, 助教 (10624926)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 虚血再灌流 / 網膜 / 水素ガス

Outline of Annual Research Achievements

当初マウスを用いて網膜虚血再灌流障害もモデルを作成できるよう試行錯誤を繰り返していたが、マウスは眼球が小さいこともあり、なかなか安定して網膜障害モデルを作成することが困難であった。そのため動物をラットに変更し、施行錯誤を行ったところ、網膜虚血再灌流障害モデルを安定して作成できた。再灌流後２日、４日、７日で網膜障害を組織切片で確認したところ、４日から７日後で明らかな網膜障害を確認した。また、モデル作成には、虚血作成時間中に十分な麻酔が必要である。当初計画の薬剤では、途中で麻酔が浅くなることでモデル作成に支障をきたしていたが、麻酔薬を変更して1時間以上安定してモデル作成ができるようになった。
ラットで網膜虚血再灌流モデルを作成後7日で眼球を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン切片を作成し、組織学的に検討した結果、網膜全
層にわたる変性所見とＧＦＡＰの免疫染色で強陽性を認めた。現在、アポトーシス検出を行っているところである。今後、ラットでの虚血再灌流作成時に２％水素吸入を併用し、その網膜組織障害の抑制効果を検討する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

計画当初はマウスを用いて網膜虚血再灌流障害モデルを作成するように努力していたが、種々方法を変えて検討してもなかなかきれいなモデルを作成するのが困難であった。そこで、モデル動物をラットに変更した結果、ラットを用いた網膜の虚血再灌流障害モデルを安定して作成することができた。網膜障害モデルの確認は、すべて組織切片を作成して行うため、毎回の方法変更に伴うモデル作成のチェックには時間を要した。その結果、１年以上の時間をモデル作成と確立に要した。
当初の研究計画よりも進捗が若干遅れているが、今年度はラットを用いて水素ガス吸入の網膜虚血再灌流障害への効果を検討する予定である。

Strategy for Future Research Activity

ラットの網膜の虚血再灌流障害モデルを用いて２％水素吸入による効果を組織学的、生化学的に非吸入群と比較検討していく。
ラットで網膜虚血再灌流障害を作成中に2％水素ガス吸入を行った群と行わなかった群で、虚血後４日後、7日後に眼球を摘出する。パラフィン切片あるいは凍結切片を作成し、網膜の各層の厚みと網膜神経細胞数を測定して評価する。また、TUNEL染色によるアポトーシス細胞数と網膜内の分布を評価する。免疫染色では、酸化ストレスマーカである4-hydroxynonenal (4-HNE)、8-hydroxy-2-deoxyguanosine (8-OHdG)、HIF-1(hypoxia induced factor)、HSP (heat shock protein) の免疫染色を行う。免疫染色はグレーディングを行い、スコア化して評価する。

Causes of Carryover

網膜虚血再灌流モデルの作成に想定以上の時間を要したことが最大の理由である。しかし、ラットを用いて動物モデルを確立できたので、計画に基づいて研究を着実に実施する予定である。研究費は、ラット購入費および飼育費、免疫染色に必要な物品購入費等に充てる予定である。今年は、新型コロナウイルス感染症のため学会発表と参加は困難と予想しており、学会発表の費用は予定していない。