2018 Fiscal Year Research-status Report
クローディンの多量体形成に着目した膠様滴状角膜ジストロフィの病態解明
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18K09446
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
川崎 諭 大阪大学, 医学系研究科, 特任准教授(常勤) (60347458)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
辻川 元一 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (70419472)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 膠様滴状角膜ジストロフィ / クローディン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膠様滴状角膜ジストロフィ(GDLD)は、タイトジャンクション構成タンパクであるクローディン（CLDN）1および7タンパクの細胞膜への移行障害とそれに伴う分解亢進が生じ、最終的に角膜上皮バリア機能が低下して涙液中のラクトフェリンが角膜組織に浸透してアミロイド形成することが原因と考えられている。しかしTACSTD2の遺伝子変異からこの分子病態に至る詳細な分子メカニズムについては未だ明らかでない。本プロジェクトでは、「TACSTD2がCLDN1および7に結合することでそれらのオリゴマー形成を適正な状態に制御しており、一方でGDLDではTACSTD2が機能しないためにCLDN1および7のオリゴマー形成が過剰となって凝集塊を形成し、結果不良タンパクと認識されてオートファジーなどによって分解される」という仮説のもとGDLDの詳細な分子病態を探索する。
平成30年度に我々はHeLa細胞およびGDLD患者由来をモデル細胞として、CLDN7タンパクの状態がTACSTD2タンパクの存在の有無によりどう変化するかについて検討した。
また本プロジェクトに利用するためのGDLDのモデル細胞として、不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T細胞）からGDLDの責任遺伝子であるTACSTD2とそのパラログ遺伝子であるEpCAM遺伝子をダブルノックアウトした細胞（Double Knock-out 細胞：DKO細胞）を作製した。HeLa細胞では上皮細胞として重要な遺伝子であるE-cadherinを発現していないために上皮としての性質が弱く、モデル細胞として適正でない可能性が否定できず本細胞を作製することとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに我々はHeLa細胞にCLDN1および7遺伝子を強制導入し、テトラサイクリン誘導下にTACSTD2遺伝子を発現するGDLDのモデル細胞を構築した。テトラサイクリン添加によってTACSTD2遺伝子の発現を誘導するとCLDN1およびCLDN7タンパクが細胞内部の核周囲から細胞膜へと移動することが観察され、TACSTD2タンパクの有無がCLDN1および7の局在に影響することが確認された。また細胞内部に局在するCLDN1および7タンパクは凝集体の様相を示し、我々の仮説に沿ったエビデンスとなった。このGDLD病態モデル細胞を用いて、TACSTD2タンパクの存在の有無によってCLDN7タンパクの状態がどのように変化するかについてBlue Native PAGEを用いて検討したところ、CLDN7タンパクはTACSTD2タンパクが存在しない状況では高分子域に泳動され、TACSTD2タンパクが存在しない状況では低分子域に泳動された。このことはTACSTD2タンパクが存在しない状況ではCLDN7が多量体を形成していることを示唆し、我々の仮説を支持することとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の展開としては、１．AxxxGモチーフが結合サイトであるかどうかを検討する、２．CLDN7タンパクの凝集体がどのような経路で分解されるかについて検討することとする。具体的には今年度に作成したDKO細胞を用いて、AxxxGモチーフに変異導入する、凝集体を形成せずTACSTD2タンパクに非依存性に細胞膜へと移行するCLDN4にAxxxGモチーフを導入するなどの手法によってAxxxGモチーフが結合サイトであるかどうかを検討し、分解経路としてメジャーな２経路（ユビキチン・プロテアソーム経路、オートファジー経路）の阻害剤を使うなどしてCLDN1および7の分解経路について検討する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額53,414円は、細胞培養に安価な培地が利用できたこと、キャンペーン割引が利用できたことにより生じた。次年度の細胞培養実験等に用いる予定としている。
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Research Products
(1 results)
