2020 Fiscal Year Research-status Report
クローディンの多量体形成に着目した膠様滴状角膜ジストロフィの病態解明
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18K09446
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
川崎 諭 大阪大学, 医学系研究科, 特任准教授(常勤) (60347458)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
辻川 元一 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (70419472)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 膠様滴状角膜ジストロフィ / クローディン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膠様滴状角膜ジストロフィ(GDLD)は、タイトジャンクション構成タンパクであるクローディン（CLDN）1および7タンパクの細胞膜への移行障害とそれに伴う分解亢進が生じ、最終的に角膜上皮バリア機能が低下して涙液中のラクトフェリンが角膜組織に浸透してアミロイド線維を形成することが原因と考えられている。しかし TACSTD2の遺伝子変異からCLDN1および7の分解亢進に至る詳細な分子メカニズムについては未だ明らかでない。本プロジェクトでは、「TACSTD2がCLDN1および7に結合するこ とでそれらのオリゴマー形成を適正な状態に制御しており、一方でGDLDではTACSTD2が機能しないためにCLDN1および7のオリゴマー形成が過剰となって凝集塊を 形成し、結果不良タンパクと認識されてオートファジーなどによって分解される」という仮説のもとGDLDの詳細な分子病態を探索する。
平成30年度にGDLDのモ デル細胞として、不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T細胞）からGDLDの責任遺伝子であるTACSTD2とそのパラログ遺伝 子であるEpCAM遺伝子をダブルノックアウトし た細胞（Double Knock-out 細胞：DKO細胞）を作製した。
DKO細胞にTACSTD2の遺伝子変異を導入したところ、ミスセンス変異のいくつかにおいてTACSTD2タンパクは細胞膜に局在しないことが明らかとなった。またグリコシレーショ ンパターンについても異常となっており、ミスセンス変異によって小胞体内でフォールディングエラーを来した結果ERADの経路によってプロテアソームにおいて分解されることで機能喪失に至るものと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々はHeLa細胞にCLDN1および7遺伝子を強制導入し、テトラサイクリン誘導下にTACSTD2遺伝子を発現するGDLDのモデル細胞を構築した。テトラサイクリン添加によってTACSTD2遺伝子の発現を誘導するとCLDN1およびCLDN7タンパクが細胞内部の核周囲から細胞膜へと移動することが観察され、TACSTD2タンパクの有無がCLDN1および7の局在に影響することが確認された。また細胞内部に局在するCLDN1および7タンパクは凝集体の様相を示した。
このGDLD病態モデル細胞を用いて、TACSTD2タンパクの存在の有無によってCLDN7タンパクの状態がどのように変化するかについてBlue Native PAGEを用いて検討したところ、CLDN7タンパクはTACSTD2タンパクが存在しない状況では高分子域に泳動され、TACSTD2タンパクが存在しない状況では低分子域に泳動された。 このことはTACSTD2タンパクが存在しない状況ではCLDN7が多量体を形成していることを示唆した。また我々はGDLDのモデル細胞として、不死化ヒト角膜上皮細胞（HCE-T細胞）からGDLDの責任遺伝子であるTACSTD2とそのパラログ遺伝子であるEpCAM遺伝子をダブルノックアウトした細胞 を作製した。この細胞はGDLDにおけるCLDN1および7の局在、発現とほぼ同じ表現型を示した。さらにこの細胞をもちいて、ミスセンス変異によるGDLD発症のメカ ニズムについても検討した。ミスセンス変異によってTACSTD2は本来局在すべき細胞膜に局在せず、またグリコシレーションについても異常なパターンを示し た。恐らくミスセンス変異によって小胞体膜上でフォールディングエラーを来した結果分解されるものと考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はCLDN7タンパクの凝集過程とその分解経路についてさらに検討する こととする。また、ミスセンス変異をもつTACSTD2遺伝子はこれまで発現するものの機能喪失していると考えていたが、多くのミスセンス変異においてTACSTD2タンパクが小胞体内部においてフォールディングエラーを生じ、ERAD （Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation）の経路によって分解されることがわかった。これについても検討していく予定である。
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| Causes of Carryover |
実験に使用する細胞の樹立、および強制発現のためのプラスミドの作製にやや時間がかかったため次年度に計画を延長した。CLDN7タンパクの凝集家庭とその分解経路について検討する こと、およびミスセンス変異をもつTACSTD2タンパクの分解について検討することとする。
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