優性遺伝性網膜ジストロフィiPS細胞を用いた遺伝子編集治療モデルの検討

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09458
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 村上 晶 順天堂大学, 医学部, 教授 (90157743)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 新井 英介 順天堂大学, 医学部, 非常勤助教 (60568210)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 遺伝子編集 / 錐体桿体ジストロフィ / 疾患iPS細胞 / 網膜色素変性 / CRISPR/Cas9

Outline of Annual Research Achievements

常染色体優性遺伝形式をとる重篤な視力低下を思春期以降にきたす錐体杆体ジストロフィ のひとつに、GUANYLATE CYCLASE 2D（GUCY2D）の点変異でおこるCone- Rod Dystrophy 6（ CRD6 ）がある。GUCY2Dは網膜視細胞に特異的に発現する遺伝子であり、視細胞内のカルシウムイオ ン濃度に対応してGUANYLATE CYCLASE活性が調整されないことにより細胞内のcGMPの濃度の異常が視細胞の細胞死を引き起こすことが推定されている。したがって変異アレルの発現を抑制することで進行を抑制しうることが期待される。CRISPR/Cas9技術は、標的配列に対する特異性が高くゲノム編集を生体内で直接修復する遺伝子治療研究を開始した。しかしターゲットとする塩基配列の領域が他の遺伝子との相同性がたかくoff-targetな編集をおこす可能性が高くなる問題が危惧された。本疾患の複数の患者とその家族の協力がえられて家系内の遺伝子解析をおこない、GUCY2D変異の上流に存在する一塩基多型を検索し、正常アレルと変異アレルの区別が可能なSNPを同定することができた。正常者と患者からのiPSCを作成した。GUCY2D遺伝子内のヘテロ接合を示すSNPを標的としたgRNAの設計をおこないそれぞれの細胞の遺伝子編集をおこなうための研究を開始した。これまでに、研究でGUCY2Dの遺伝子発現は網膜視細胞にのみ発現が確認されているため、遺伝子編集をおこなった、コントロールおよび疾患iPSC の網膜オルガノイドを作成し研究を行い、変異RNAの発現の抑制の有無の確認をおこなっている。
同時に治療候補となる、他の優性遺伝を示す網膜変性疾患をもつ家系について遺伝子解析を行っていく。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本疾患の複数の患者とその家族の協力がえられて家系内の遺伝子解析をおこない、GUCY2D変異の上流に存在する一塩基多型を検索し、正常アレルと変異アレルの区別が可能なSNPを同定した。正常者と患者からのiPSCを作成した。GUCY2D遺伝子内のヘテロ接合を示すSNPを標的としたgRNAの設計をおこない、そのSNPのあとに停止コドンを導入する遺伝子編集をおこなった。GUCY2Dの発現は網膜細胞特異性が高いため、コントロールおよび疾患iPSCから 網膜オルガノイドを作成し、その発現を確認をおこなった。しかし網膜オルガノイドの分化誘導に長期間を要するとともに、分化効率がかならずしも高くないため変異アレルと正常アレルの発現量の比較および細胞の生化学的な解析までいたっていない。、
同時に、治療候補となる錐体桿体ジストロフィ、網膜変性疾患の遺伝子解析を次世代シークエンスで新たに60症例の解析をおこなっているが、こちらは順調に進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

十分な生化学的な解析をおこなうため、短期間で網膜視細胞への分化誘導を可能にする手法の検討を行いながら、アレル特異的な遺伝子編集によりターゲットとする変異アレルの発現が抑制されているかを探索する。
現在遺伝子解析をおこなっている網膜変性疾患で同様の編集がおこないうる例がないかを探索する。