2018 Fiscal Year Research-status Report
長い神経欠損に対するハイブリット型人工神経を用いた生体内再生治療
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18K09491
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
市原 理司 順天堂大学, 医学部, 助教 (40599247)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 礼人 順天堂大学, 医学部, 教授 (10365645)
丸山 祐一郎 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80181840)
原 章 順天堂大学, 医学部, 准教授 (50327839)
吉澤 秀和 順天堂大学, 医学部, 非常勤助教 (10512593)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 末梢神経再生 / ハイブリッド型人工神経 / 端側神経縫合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は実験モデルの作成に主眼を置き研究を遂行した。実験モデルの作成は当施設の動物実験室にて行った。神経損傷後の長い神経欠損をハイブリッド型人工神経で架橋した際に再生した軸索の伸長を評価するのに蛍光発色するマウスを用いた手法は末梢神経再生研究において重要であり,我々もこの手法を用いての評価法を選択した。共同研究者である林がこれまでの末梢神経再生研究で使用していた２種類の蛍光発色マウスを用いることとし,すべての神経が発色するThy1-YFP16 マウスとシュワン細胞が幼若化すると蛍光発色するNestin-GFP マウスを予め受精卵として凍結保存していたものを孵化させ使用した。我々の研究の特徴はこれらマウスを生きたまま観察するLive imaging法が神経再生を評価する上で重要な評価法の一つであり,これら遺伝子改変マウスが実際に発色するかを吸入麻酔下で５色の蛍光フィルターを有する蛍光実体顕微鏡を用いて観察した。耳介、尾部では皮膚を透過してマウスの末梢神経が蛍光緑色に発色しているのが確認された。更にハイブリッド型人工神経を作成する際に,ドナー神経にある程度の損傷を加えることで多くのシュワン細胞が遊走することを確認するために,Thy1-YFP16マウスの坐骨神経を顕微鏡下で微小血管外科操作セットを用いて鋭的に損傷させ神経発芽を確認した。我々の実験系では上記の様に正常な坐骨神経を部分損傷させ同部位に人工神経を端側神経縫合することで神経発芽を促しシュワン細胞を人工神経内へ誘導することでハイブリッド型人工神経を作成することが重要な手技となる。そこで、実際に使用する人工神経と同程度の弾性を有する小児輸液用のカテーテルを人工神経に見立てて同様の手技を行うことで端側神経縫合を行った。やや手技は煩雑であったが,端側神経縫合は可能であることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
動物実験室の大規模改修のため平成31年2月まで実験室使用が不可能となっていたため,現在新たに遺伝子改変マウスの孵化をおこなっており,実験開始が本年度中旬になる予定。
モデル作成に必要な微小血管外科操作セット、蛍光実体顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡、画像解析電算機器、組織切片作成のクリオスタット、インキュベーターなどの主要設備の準備は完了した。
マウス坐骨神経での神経損傷モデル作成、人工神経の端側吻合によるハイブリッド型人工神経作成の実験系は確立した。
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| Strategy for Future Research Activity |
マウス坐骨神経での神経損傷モデルの作成はマウスが使用可能となり次第行う。
マウス坐骨神経への人工神経の端側神経縫合によるハイブリッド型人工神経の作成はマウスが使用可能となり次第行う。
モデル作成後はマウスを生きたまま観察するLive imaging法でハイブリッド型人工神経内における再生軸索伸長の様子を継時的に測定しデータ化する。また、人工神経の遠位断端まで再生軸索の伸長が確認できた時点で共焦点レーザー顕微鏡を用いて人工神経の近位、遠位を含む坐骨神経全体のWhole mount imaging法による神経再生評価を行う。
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| Causes of Carryover |
当該年度での動物実験が動物実験室の大規模改修工事により2018年11月から2019年2月まで閉鎖となったため、飼育費や施設利用費などへの計上とならなかったためである。
次年度は、動物モデルの作成、末梢神経再生評価のために必要な試薬の購入、国内・国外学会での発表のための旅費として使用の予定である。
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