2019 Fiscal Year Research-status Report
長い神経欠損に対するハイブリット型人工神経を用いた生体内再生治療
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18K09491
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
市原 理司 順天堂大学, 医学部, 助教 (40599247)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 礼人 順天堂大学, 医学部, 教授 (10365645)
丸山 祐一郎 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80181840)
原 章 順天堂大学, 医学部, 准教授 (50327839)
吉澤 秀和 順天堂大学, 医学部, 非常勤助教 (10512593)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ハイブリッド型人工神経 / 端側神経縫合 / 末梢神経再生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は2018年に引き続き実験モデルの作成に主眼を置き研究を遂行した。再生してきた軸索の伸長を評価するのに遺伝子改変により神経組織が蛍光発色するマウスを用いる評価法は、末梢神経再生研究において重要な評価法である。共同研究者である林がこれまで末梢神経再生研究で使用していた２種類の蛍光発色マウス、すべての神経が発色するThy1-YFP16 マウスとシュワン細胞が幼若化すると蛍光発色するNestin-GFP マウスを本実験でも使用するために、予め受精卵として凍結保存していたものを孵化させ使用した。本研究の大きな特徴はマウスを吸入麻酔下で生きたまま観察する“Live imaging”が神経再生を評価する上で重要な評価法の一つであり,これら遺伝子改変マウスが実際に発色するかを蛍光実体顕微鏡にて確認した。次にシュワン細胞充填型人工神経を作成するために,ドナーサイトとなるマウス坐骨神経に損傷を加える方法を確立した。具体的にはThy1-YFP16マウスの坐骨神経を顕微鏡下で微小血管外科操作セットを用いて鋭的に損傷させ1週間後に旺盛な神経発芽を確認した。本実験系では上記損傷部位に人工神経を端側神経縫合することで神経発芽を促しシュワン細胞を人工神経内へ誘導することでハイブリッド型人工神経を作成することがモデル作成の過程での重要な手技となる。現在、実際に使用する人工神経と同程度の弾性を有する小児輸液用のカテーテルを人工神経に見立てて端側神経縫合を数回練習した後にモデル作成を開始している。やや手技は煩雑ではあるが,端側神経縫合は可能であり既に一定数のモデル作成が完了している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
動物実験室の大規模改修が2019年2月に完了したため遺伝子改変マウスを動物実験室へ搬入した.遺伝子改変マウスの個体数維持のためwildのマウスとの交配を行った.孵化したラットは遺伝子検査のため全例で尾部をカットしPCR法にて遺伝子改変マウスか否かの検査を行った.現在Thy1-YFP,Nestin GFPともに15匹程度の遺伝子改変マウスの個体が維持できている.動物実験は,吸入麻酔薬（セボフルラン）を用いて遺伝子改変マウスに麻酔をかけた後に,大腿骨をマーキングし約1㎝の皮膚切開を置いて大腿骨深部にある坐骨神経を同定する.坐骨神経周囲の剥離した状態で、蛍光実体顕微鏡を用いて坐骨神経が蛍光発色（緑色）していることを確認する.剖出した坐骨神経のやや近位部に21G注射針を用いて神経周膜を損傷させperineural windowを作成する.作成後に再度蛍光実体顕微鏡下で,周膜損傷部での坐骨神経実質が露出されていることを確認する.人工神経(0.4mm)を用いて坐骨神経損傷部を被覆する様に11-0ナイロンで端側吻合を行う.吻合した人工神経が神経周囲の筋膜内に収納できるように筋膜縫合・皮膚縫合して実験は終了としている.
ここまでを2020年3月初旬までに終了した時点で,新型コロナウイルス感染により動物実験室の使用が禁止となっており、現段階では再開の見通しが立たない状況である.この事態は研究を遂行するうえで大きな問題であり、動物実験の段階で中止期間が遷延すると,今後の実験結果の評価のための組織評価（Live imaging評価,Whole amount標本での免疫染色,電子顕微鏡による軸索やミエリンの評価）などに多大な影響を与える可能性が避けられない.
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| Strategy for Future Research Activity |
現在の問題点として,0.4mmの人工神経を用いた実験モデルでは3週経過後に手術創を再度展開すると,人工神経の形状が確認できない事態が発生している.人工神経の素材であるコラーゲンの分解速度が人体と比較し早いことが考えられるため1.0mmの人工神経を用いた実験モデルの作成も並行して行っている.
実験モデルの作成が終了後は,マウスを吸入麻酔下で観察するLive imaging法を用いて,人工神経管内における再生軸索伸長の様子を継時的(1.3.5週を予定)に測定し伸長距離などのデータを取得する予定である.また,人工神経の遠位断端まで再生軸索の伸長が確認できた時点で共焦点レーザー顕微鏡を用いて人工神経の近位、遠位を含む坐骨神経全体のWhole mount imaging法による軸索やシュワン細胞などの再生評価、さらには神経筋接合部での再生評価や腓腹筋の筋量や筋細胞の組織評価を健側と比較しながら行い、旺盛な神経再生を証明するために,電子顕微鏡を用いて近位断端,人工神経管内,遠位断端での有髄軸索数,軸索・髄鞘径などの計測を行う予定である.
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| Causes of Carryover |
本年度中に行う予定であった動物実験ならびに動物実験の結果をもとに行う組織学的評価に関して、コロナウイルス感染症の蔓延により動物実験室の使用が禁止となり遅れが生じている。それに伴い、組織学的評価の際に使用する試薬の購入、組織標本作成のための費用などの支出が行われていない。次年度に動物実験が再開になった時点で必ず必要となる支出であり、さらには、これら実験から得られた知見を世に問うために、国際・国内における当該学会での発表や、英文論文作成に要する費用（英文校正・投稿料）での支出も見込まれる。
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