2018 Fiscal Year Research-status Report
創傷治癒過程に出現する脂肪細胞由来線維芽細胞の形質及び機能解析
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18K09497
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
風間 智彦 日本大学, 医学部, 助手 (80525668)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松本 太郎 日本大学, 医学部, 教授 (50366580)
長岡 悠紀 日本大学, 医学部, 研究員 (30789186)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 脱分化脂肪細胞 / DFAT / 脱分化 / 成熟脂肪細胞 / tdTomato / 皮膚全層欠損 / 間葉系幹細胞 / ペリサイト |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は Adipoq-ERT2Cre/tdTマウスに２種類の皮膚障害 (皮膚全層欠損、ブレオマイシンによる強皮症様病変)を誘導し、出現するペリリピン陰性tdT陽性細胞(Adipocyte-derived fibroblast-like cell: ADF)の局在、形質および機能解析を行なうとともに、さらに種々のシグナル阻害薬などを用いてADF出現に関わる分子メカニズムを明らかにすることを目的としている。本年度において、脂肪細胞の運命追跡を可能とするレポ－ターマウス：Adipoq- CreERT2/tdTマウスにtamoxifen 1mgを5日間腹腔内投与後、背部に1cm×1cmの皮膚全層欠損創を作製した。創部保護のため、ハイドロコロイドドレッシング剤で創部を被蓋した。欠損作製時、欠損作製後1週間、2週間、3週間のタイムポイントで欠損部の組織標本を作製し、tdTomatoの発現を組織学的に評価した。その結果、マウスにおける皮膚全層欠損作製により、欠損部の肉芽組織に成熟脂肪細胞由来のADFの出現を確認した。欠損部中のADFの細胞数をカウントしたところ、皮膚欠損作製後1週間から2週間で急激に増加した後、皮膚欠損作製後3週間で減少していくことから、ADFは組織障害により出現し組織の修復に伴って減少していくことが示された。そのtdTomato陽性ADFの一部はDLK1（前駆脂肪細胞マーカー）、Sca-1（間葉系幹細胞マーカー）、PDGFRα（間葉系幹細胞マーカー）そしてNG2（ペリサイトマーカー）を発現していたことから皮膚欠損後の治癒過程で成熟脂肪細胞に由来する線維芽細胞様細胞が出現し、その一部は肉芽組織内で間葉系幹細胞（MSC）、前駆脂肪細胞、ペリサイトへの形質転換の可能性が示唆された。しかし、平滑筋や血管への分化は確認できず組織修復への直接的な関与は確認できなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2018年度において、Adipoq-ERT2Cre/tdTマウスにタモキシフェンを5日間投与後、背部皮膚に1×1㎝の皮膚全層欠損を作製し、モデル作製より１、2、3、4週間後の時点で欠損部皮膚組織を採取し、再生皮膚の組織学的検討を行う予定であった。当初の予定通り実験計画を遂行することができ、tdTomatoの蛍光はtamoxifen投与後のマウスの腸間膜や結合組織中の脂肪組織にのみ認められ、肝臓、腎臓、肺といった実質臓器はすべてtdTomato陰性であることを確認するとともに、皮下組織にはtdTomato陽性を示す2層の脂肪組織が存在し、これらはPerilipinの局在と完全にマージすることから、tdTomatoが脂肪細胞のみに発現していることが確認できた。また、脂肪組織中の微小血管や間質細胞はtdTomato陰性であり、脂肪滴をもつ成熟脂肪細胞のみがtdTomatoを発現していることを確認することができた。また、皮膚欠損作製後1週間で、欠損部の脂肪組織周囲に成熟脂肪細胞マーカーperilipin陰性で線維芽細胞様形態を示すtdTomato陽性ADFの出現を認め、皮膚欠損作製後2週間をピークに肉芽組織内でも確認された。欠損部中のtdTomato陽性ADFの細胞数をカウントしたところ皮膚欠損作製後1週間、2週間で急激に増加した後、皮膚欠損作製後3週間で減少していくことを明らかにした。さらに、tdTomato陽性ADFの一部はDLK1（前駆脂肪細胞マーカー）、Sca-1（間葉系幹細胞マーカー）、PDGFRα（間葉系幹細胞マーカー）、NG2（ペリサイトマーカー）、そしてKi-67（細胞増殖マーカー）を発現していることを明らかにした。以上の結果より、現在の進捗状況はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度においては、タモキシフェン投与後のAdipoq-ERT2Cre/tdTマウス背部皮膚に皮膚全層欠損とは異なる皮膚障害として、ブレオマイシン10 mg/mL を4週間皮下注射することにより、強皮症に類似した慢性炎症を伴う線維化病変を惹起する。モデル作製0、2、4、8週間後の時点で、欠損部皮膚組織を採取し、2018年度に実施した皮膚全層欠損モデルマウスと同様に組織学的検討を行う。ADFの局在変化や細胞表面マーカー、分化の有無、細胞外基質の発現、増殖活性などを皮膚全層欠損モデルと比較し、その差異を明らかにする。また、上記2種類のモデルマウスにおける病変皮膚組織を採取後、酵素処理により組織中の細胞を単離し付着培養する。ある程度増殖させたのち、tdT陽性ADFをセルソーター（現有機器）にて選別する。単離したADFは、フローサイトメトリーによる細胞表面マーカー解析やマイクロアレイ法による遺伝子発現解析を行ない、その細胞形質を明らかにする。またCFU-Fアッセイ、分化誘導実験（骨・脂肪・軟骨）、細胞外基質やサイトカインの発現解析を行い、ADFの機能を明らかにする。これらの細胞形質や機能が2種類のモデルマウス間で差異があるか明らかにする。
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Research Products
(1 results)
