2019 Fiscal Year Research-status Report
細胞凝集形成を介した間葉系幹細胞分化開始メカニズムの解明
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18K09515
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| Research Institution | Tsurumi University |
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Principal Investigator |
二藤 彰 鶴見大学, 歯学部, 教授 (00240747)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
出野 尚 鶴見大学, 歯学部, 助教 (40435699)
江面 陽一 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 准教授 (50333456)
中島 和久 鶴見大学, 歯学部, 講師 (90252692)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細胞分化 / 骨格組織 / 遺伝子発現 / タンパク発現 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
個体での骨や歯の原基発生は細胞凝集(Cell condensation)の形成から始まり、様々な組織の分化誘導にも3次元凝集塊形成が有用であることが知られているが、そこでの分化開始の分子メカニズムについては不明な点が多い。本研究では多分化能を持つ間葉系細胞株C1を用い、細胞凝集形成を経て特異的な細胞系譜へ分化する過程を用い、高解像度イメージングによって一細胞レベルの解像度での解析を行う。今年度は、細胞間情報伝達に必要なNotch-Deltaシグナルと3次元的組織形成に必要なHippo-Yapシグナル経路を調節することでC1の細胞周期と分化形質、そして細胞凝集がどう変化するかを調べた。前者のシグナルについてはγ-secretase inhibitorである、DAPT、ならびにLY-411575を用い、また後者のシグナル経路についてはselective and ATP-competitive MST1/2 inhibitorであるXMU-MP-1を用いた。cell aggregate を含む monolayer においてDAPT、ならびにLY-411575で処理すると、細胞凝集そのものに大きな形態的変化は認められないが、G1期早期の細胞（mVenus陽性）が減少していた。更にそれに伴いrunx2発現細胞が減少していた。またその効果はinhibitorの濃度依存的であるように見えた。一方、XMU-MP-1処理ではmVenus陽性が増加していたが、必ずしもrunx2発現細胞は増加していなかった。
一方、別の間葉系幹細胞である１０T1/2細胞においても、同様に分化形質、そして細胞凝集の関係を観察した。この細胞においても細胞凝集に伴い、runx2発現細胞が増加していることを確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では前年度の結果で得られた、2次元のmonolayerに細胞がpile upしたcell aggregateを形成する培養方法を中心に、細胞凝集と分化形質に関わる分子メカニズムを調べるために、候補となるいくつかのシグナル経路についてその影響を解析した。Notch-DeltaシグナルとHippo-Yapシグナルについて一定の結果を得られたが、主として阻害薬を用いた結果であったため、別のアプローチでも確認する予定であった。実験条件の検討から行っているが、いまのところ十分な結果は得られていない。また、画像として得られた結果について定量的な解析を重ね統計処理して比較する予定であったが、一部の解析しか行っておらず、まだ十分な数の結果を得られていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はNotch-DeltaシグナルとHippo-Yapシグナルについて、それぞれに関わる分子についてノックダウンすることで、細胞周期と分化形質、そして細胞凝集がどう変化するかを調べる予定である。また本研究で開発したmonolayerでのsparseとaggregateの混合培養方法では、同じプレート上で、異なる細胞凝集状態での細胞機能の違いを観察するには適している。しかしながら、画像データを定量的解析行うためには、monolayerとaggregateそれぞれについて多数の画像を取り込んだ上で、それぞれを一定の基準のもと自動的に解析できるデータ解析ソフトウェアの応用が必要である。すでに画像データを解析するためのソフトウェアの改変を試行しており、それを完成することで共焦点画像データの分析を定量的に行うことができると考えている。
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