2018 Fiscal Year Research-status Report
RANKL/OPGリソソーム選別輸送制御による骨代謝動態の解明
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18K09516
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| Research Institution | Osaka Dental University |
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Principal Investigator |
納富 拓也 大阪歯科大学, 歯学部, 講師 (70542249)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | RANKL / OPG |
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| Outline of Annual Research Achievements |
老化や閉経に伴う骨粗鬆症患者数は1000万人といわれ、高齢化社会をむかえて、その患者数は増加し続けている。この骨粗鬆症を含む骨疾患に関する研究は、骨吸収を抑制することを目的として、RANKL分子を中心として進展してきたが、反作用を持つ破骨細胞分化抑制因子OPGについては、応用する研究は少ない。骨芽細胞でのRANKLとOPGを含むリソソーム小胞の細胞膜への輸送は分子毎に不均一であり、これはリソソーム小胞が分子/刺激条件に応じて、選別輸送されることを示す。OPGを骨疾患に応用するには、RANKL/OPG選別輸送条件とともに、細胞生物学の核心的課題の一つであるオルガネラ選別輸送機序を明らかにする必要がある。本研究では、リソソーム小胞を介したRANKL/OPG選別輸送条件探索と生体内応用を主目的として、オルガネラ選別輸送機序に焦点を当てる。本年度では、RANKL/OPGリソソーム選別輸送の発生条件スクリーニングを中心に検討した。我々の先行報告で、副甲状腺ホルモン（PTH: Parathyriod hormone）、活性化型ビタミンD3（VD3: Vitamin D3）、細胞の膜電位変化（脱分極）の刺激により、RANKL含有リソソーム小胞は細胞膜に移行するが、OPG含有リソソーム小胞の移行は少ないことを明らかにした。RANKL, OPGの分子末端に蛍光分子（VenusもしくはCherry）を付加した分子を作成後、骨芽細胞株(MC3T3-E1)もしくは頭頂骨由来骨芽細胞に遺伝子導入して、各種刺激条件による蛍光分子の移行をウェスタンブロッティングにて検討した。力学的刺激、水流刺激、低分子化合物（２種類）の添加を行い検討したところ、いずれもRANKL蛍光分子は迅速に細胞膜分画にて検出されたが、OPG蛍光分子の検出について、一致した結果を得ることはできなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
分子輸送の発生条件スクリーニングは、条件検討に時間を要するが、順調に進んでいる。また、光操作分子を用いた輸送機構の光制御については、リソソーム局在を可能とするための発現ベクター作成を進めている。また、発展的研究として、本研究で着目しているRANKLと力学的刺激応答分子の関係を検討することで、新知見を得ている。
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| Strategy for Future Research Activity |
分子輸送の発生条件については、引き続き検討を進める。輸送機構の光制御の検討では、リソソーム膜電位制御を可能とするための基礎データ取得を目指して、リソソームに対してパッチクランプ法を適用するための改良を行っていく。
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| Causes of Carryover |
分子輸送の発生条件の探索、データの再現性確認のため時間を要したことと、大学共通施設利用のための準備が遅れたためである。具体的には、培養実験減少のために、消耗品費が少なくなったことと、共通施設利用頻度の減少である。実験回数の減少に応じて、人件費・消耗品費の減少が生じた。
実施できなかった培養実験および次年度計画にある動物実験計画を迅速に進めて、今年度に計画していた通り、消耗品費（試薬・培養器具・実験動物）にあてる予定である。また、増加予定である実験を速やかに推進するために、実験補助員増員のための短期雇用に充てる。
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