2019 Fiscal Year Research-status Report
RANKL/OPGリソソーム選別輸送制御による骨代謝動態の解明
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18K09516
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| Research Institution | Osaka Dental University |
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Principal Investigator |
納富 拓也 大阪歯科大学, 歯学部, 講師 (70542249)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | RANKL / OPG / 細胞膜電位 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
老化や閉経に伴う骨粗鬆症患者数は1000万人といわれ、高齢化社会をむかえて、その数は増加し続けている。この骨粗鬆症を含む骨疾患に関する研究は、骨吸収を抑制することを目的として、破骨細胞形成因子であるRANKL分子を中心として進展してきたが、反作用を持つ破骨細胞分化抑制因子OPGについては、応用研究は少ない。骨芽細胞でのRANKLとOPGを含むリソソーム小胞の細胞膜への輸送は分子毎に不均一であり、これはリソソーム小胞が分子/刺激条件に応じて選別輸送されることを示す。OPGを骨疾患に応用するには、RANKL/OPG選別輸送条件とともに、細胞生物学の核心的課題の一つであるオルガネラ選別輸送機序を明らかにする必要がある。本研究では、リソソーム小胞を介したRANKL/OPG選別輸送条件探索と生体内応用を主目的として、オルガネラ選別輸送機序に焦点を当てる。本年度では、昨年から引き続きRANKL/OPGリソソーム選別輸送の発生条件スクリーニングを中心に検討した。RANKL, OPGの分子末端に蛍光分子（VenusもしくはCherry）を付加した分子を作成後、骨細胞株(MLO-Y4)もしくは初代骨芽細胞に遺伝子導入して、各種刺激条件による蛍光分子の移行をウェスタンブロッティングにて検討した。刺激条件として、光刺激による細胞膜電位変動システムを用いて長期脱分極刺激をおこなったところ、RANKL分子は細胞膜移行が認めれたが、OPG分子の細胞膜移行は促進されなかった。この点について、細胞外イオン濃度の変化に着目して検討を進めたところ、細胞外Mg2+イオン濃度の変化により、OPGの細胞膜輸送の顕著な変化を確認した。このMg2+イオン濃度変化によるRANKL輸送への影響は少なかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
分子輸送の発生条件スクリーニングは、条件決定に時間を要しているが、順調に進んでいる。また、光操作分子を用いた輸送機構の光制御については、リソソーム局在を可能とするための発現ベクターを確立して、実験応用するための検討を開始している。また、発展的研究として、本研究で着目しているRANKLと力学的刺激応答分子の関係については、数個の候補分子を同定して実験を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
選別分子輸送の発生条件については、引き続き検討を進める。また、生体内での検討を進めるために、力学的刺激を負荷したマウスでのRANKL/OPG分子移行とその影響を骨形態計測・免疫染色にて検証していくとともに、力学的刺激を負荷したマウス由来の初代骨芽細胞を用いて、分子輸送機構の表現型変化を確認していく。
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| Causes of Carryover |
光照射実験について、データの再現性確認・解析のため時間を要したことと、大学共通施設器具設定の調整が遅れたためである。COVID-19の影響による2-3月の実験研究中断も含まれる。具体的には、新規培養実験とレーザー顕微鏡実験減少のために、消耗品費（新規試薬購入）が少なくなったことと、共通施設利用頻度の減少である。実験回数の減少に応じて、人件費・消耗品費の減少が生じた。
実施できなかった培養実験および計画にある動物実験計画を迅速に進めて、前年度に計画していた通り、消耗品費（試薬・培養器具・実験動物）にあてる予定である。また、増加予定である実験を速やかに推進するために、実験補助員増員のための短期雇用に充てる。
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