軟骨細胞分化、組織形成に関わる新規プロテインキナーゼの探索とシグナル機構の解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09518
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 高畑 佳史 大阪大学, 歯学研究科, 助教 (60635845)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 軟骨細胞 / 発生 / プロテインキナーゼ / リン酸化

Outline of Annual Research Achievements

軟骨組織は骨格の支持・成長に重要な役割を果たす。軟骨組織は、未分化間葉系細胞から軟骨細胞へと分化し、この分化過程が正常に進行することで骨格の伸長を伴う内軟骨骨形成により形成される。なかでも骨形成因子BMPはSmad分子のリン酸化を誘導し、強い骨・軟骨形成促進作用がある。しかし、その下流に存在する骨・軟骨形成を決定づけるシグナル分子やその伝達機構の詳細についてはほとんど分かっていない。従って、リン酸化に着目し、BMPにより誘導されるキナーゼ関連分子を網羅的に探索し、軟骨細胞分化に重要な因子の同定と機能解析を行った。
未分化間葉系細胞を多く含み 、多分化能を有する胎生12日目のマウス肢芽細胞を用いて、BMP2を処理することで発現の上昇するプロテインキナーゼ遺伝子をAffimetrix社のGenechipを用いたマイクロアレイにより遺伝子発現解析を行った。その際、絞り込みの条件としてBMPによって発現上昇が顕著かつ機能が全く未知であるものを検索し、新規のセリンスレオニンプロテインキナーゼを同定した。引き続き培養細胞を用いた解析を行い、肢芽細胞に新規プロテインキナーゼを過剰発現またはshRNAにて遺伝子ノックダウン後、骨・軟骨誘導培地にて分化能を検討した。その結果、新規プロテインキナーゼを過剰発現させると骨形成に必須である転写因子Runx2, Osterixの発現上昇が観察された。またshRNAによる遺伝子ノックダウンした肢芽細胞で石灰化の著明な抑制が観察された。
さらに、マウス個体における新規プロテインキナーゼの機能解析を行うため、CRISPR/Cas9法を用いて遺伝子ノックアウト(KO)マウスを作製した。このKOマウスの骨表現系を解析すると、胎生14日目の上腕骨に軽微な変化を認めた。従って新規プロテインキナーゼは間葉系幹細胞から軟骨細胞分化の制御に関与している可能性が示された。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

本研究計画では、未分化間葉系細胞から軟骨分化に重要な因子を同定し、同定したプロテインキナーゼの細胞レベルでの解析を通じて機能的役割を明らかにすることを初年度の計画目標としていた。本年度の実際の成果は、新規プロテインキナーゼを同定し、細胞レベルで軟骨細胞の石灰可能を制御することや、骨形成に必須の転写因子Runx2, Osterixの発現制御にも関わっているデータを得ることができた。さらにマウス個体における解析を進めるため、CRISPR/Cas9法による新規プロテインキナーゼのノックアウトマウス作成も完了し、骨表現系の解析も完了している。従って、当初予定していた研究計画よりも順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

本年度の研究実績では、新規プロテインキナーゼのin vitroでの解析でRunx2, Osterixの発現を制御することを示すとともに、マウス個体レベルでの機能解析を行った。特にin vivoモデルにおける個体解析を行うために、遺伝子ノックアウトマウスを作成し、その骨表現形を解析した。しかしながら、新規プロテインキナーゼのノックアウトマウスの骨表現形は野生型と比較して非常に軽微な変化であった。本研究で同定した新規プロテインキナーゼは複数のファミリー遺伝子が存在することが知られており、それらのファミリー遺伝子は構造的にも類似しているので、機能的に代償している可能性が考えられる。そのため、単純に新規プロテインキナーゼを一つ遺伝子ノックアウトしただけでは解析が不十分であるため、今後の研究方策として同一ファミリー遺伝子の複数のノックアウトマウス作成を行い、骨表現形の解析を通して新規プロテインキナーゼの骨軟骨分化に与える影響について更なる検討を重ねる予定である。