炎症性疾患におけるCX3CL1を介した破骨細胞前駆細胞の骨芽細胞層通過機構の解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09532
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 立川 敬子 東京医科歯科大学, 歯学部附属病院, 講師 (70236537)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中浜 健一 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 准教授 (60281515)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: CX3CL1 / 破骨細胞前駆細胞

Outline of Annual Research Achievements

ケモカインの１つであるCX3CL1は多くの炎症やがんの転移に関わっていることが報告されている。最近、申請者らはIL-1存在下でCX3CL1-CX3CR1依存的に破骨細胞前駆細胞(OCP)が骨芽細胞下に遊走することを報告した。その遊走経路の遮断によって破骨細胞分化が抑制されることが分かった。これらの発見は炎症性の骨疾患においてOPCの骨芽細胞下への遊走が関与する可能性を明らかにしたものである。OCPの骨芽細胞下への遊走機構の詳細はまだ明らかになっておらず、この機構を明らかにすることで全く新しい作用機序を持った骨吸収阻害剤が提案できるのではないかと考えた。本研究の目的はCX3CL1によるOCPの細胞通過機構(Transcellular migration)を分子レベルで明らかにすることにより、骨代謝回転の新たな制御方法を見出し、炎症性骨疾患の予防法および治療法を提案することである。本年度は、マウス骨髄由来骨芽細胞様細胞TMS12またはマウス頭蓋骨由来骨芽細胞にアクチン-EGFP融合タンパクとチューブリン-mCherry融合タンパクを発現させ、生細胞で細胞骨格を可視化した細胞の樹立を目指した。TMS12細胞では両融合タンパクを発現させることができたが、マウス頭蓋骨由来骨芽細胞では薬剤耐性を利用した細胞選択過程で細胞老化が起こり樹立困難であった。さらに、ウイルスベクターを用いたCX3CL1-GFP融合タンパクの発現はウイルスパッケージングの際に用いられる293FT細胞では細胞膜局在が認められたが、TMS12細胞での発現でははっきりとした細胞膜局在が認められなかった。これはGFPタグの影響であると考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

蛍光タンパク標識による細胞骨格の可視化についてはTMS12細胞でそれらの蛍光タンパク発現が認められたが、その発現強度が詳細な細胞骨格の動きを捉えられるかが課題として残っている。薬剤耐性によるさらなる蛍光強度の増加が認められるか検討したい。さらに、骨芽細胞系細胞でのCX3CL1-GFP融合タンパク発現には未だ成功に至っていない。生細胞でのCL3CL1の動的変化を捉えるためには他の蛍光タンパクと融合させる以外に方策はなく、現在他の蛍光タンパク発現ベクターに組み込むべく検討を行っている。

Strategy for Future Research Activity

今年度、研究を推進していくために以下の方策を実行する予定である。
１、アクチンおよびチューブリンは同時に発現させるのではなく、それぞれを強く発現する細胞株を樹立する。
２、CX3CL1-蛍光タンパクを細胞膜上に発現させるためにタグ蛍光タンパクの検討を行う。具体的にはeGFP, tdTomatoなどを検討する。
３、マウス頭蓋骨由来骨芽細胞を用いた各種蛍光タンパク発現細胞に樹立は断念し、間葉系幹細胞を対象に蛍光タンパク発現細胞の樹立を検討する。

Causes of Carryover

当初の計画が若干遅れているため