２成分制御系を中心としたバイオフィルム形成菌における抗菌薬抵抗性メカニズムの解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K09535
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 村上 圭史 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 准教授 (10335804)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 天羽 崇 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 特任助教 (00803545) ; 藤猪 英樹 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 教授 (50356250)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 緑膿菌 / ２成分制御系 / バイオフィルム

Outline of Annual Research Achievements

う蝕，歯周病をはじめとするバイオフィルム感染症が慢性化，難治化する原因の１つとして抗菌薬抵抗性の重要性が認識されつつあるものの，そのメカニズムについてはまだ不明な点が多い。我々はこれまでに，バイオフィルムのモデル細菌である緑膿菌について，抗菌薬抵抗性に関与する因子として，RNAポリメラーゼσ因子，セカンドメッセンジャーであるc-di-GMP，菌体外多糖合成に関わるpsl遺伝子，２成分制御系などが重要な役割を担っていることを報告してきた。本研究では，２成分制御系であるcbrA-B, phoB-Rに着目し，シグナル伝達経路を明らかにすることにより，抗菌薬抵抗性メカニズムの解明し，さらにマウス慢性感染モデル系を確立し，これまでのin vitroでの実験系だけではなく，in vivoでの抗菌薬抵抗性を解析し，慢性難治性感染症であるバイオフィルム感染症に対する，新たな治療薬のターゲットを見出すことを目標としている。
1) 抗CbrB, 抗PhoBポリクロナール抗体の作製：His-Tag融合タンパク質用のベクターへのcbrB, phoB遺伝子のクローニングに成功し，大腸菌での大量発現，タンパク質の精製を実施中である。
2) cbrB, phoB遺伝子欠損株での，トランスクリプトーム解析：トランスクリプトーム解析については，当初RNA-seqによる解析を実施する予定であったが，現在，マイクロアレイを用いた解析法に変更し，実施予定である。
3) 強発光緑膿菌の作製：発光強度の強い緑膿菌の作製に成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1) 抗CbrB, 抗PhoBポリクロナール抗体の作製：His-Tagベクターへのそれぞれの遺伝子のクローニングに成功し，大腸菌での大量発現を実施したところ，CbrBタンパク質は成功したものの，PhoBタンパク質は発現の誘導がみられないため，宿主大腸菌の変更などを予定している。また，CbrBタンパク質はカラム精製まで成功しているため，もう少し，収量を増やし，ウサギへの免疫を実施する予定である。
2) cbrB, phoB遺伝子欠損株での，トランスクリプトーム解析：トランスクリプトーム解析については，当初RNA-seqによる解析を予定していたが、解析が予想以上に困難であることが分かったため、マイクロアレイを用いた解析法に変更し，そのプロトコールについて検討を行っている。
3) 強発光緑膿菌の作製：２つのプロモーターとプラスミドの組み合わせで，発光強度の強い緑膿菌の作製に成功した。

Strategy for Future Research Activity

CbrBタンパク質の精製を行い，抗CbrB抗体の作製を実施する。PhoBタンパク質については，宿主である大腸菌を変更し，発現条件を検討するなどして，大量発現に向けてさらなる検討を行う。抗Cbr抗体が作製出来れば，Chip-seq解析を実施し，制御遺伝子を探索する。また，トランスクリプトーム解析については，バイオフィルムから菌体を大量に回収する方法などを検討し，マイクロアレイを用いて検討を行う。

Causes of Carryover

理由：CbrBやPhoBタンパク質のタンパク精製が完了できず抗体作製が実施出来なかったため。
使用計画：タンパク質精製を継続し、次年度抗体作製を実施する予定である。