2020 Fiscal Year Research-status Report
亜鉛の恒常性の破綻とエキソソームを介した軟骨代謝異常の解析
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18K09540
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| Research Institution | Showa University |
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Principal Investigator |
安原 理佳 昭和大学, 歯学部, 講師 (20453649)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川嶋 章弘 昭和大学, 医学部, 講師 (10783376)
田中 準一 昭和大学, 歯学部, 講師 (40710166)
美島 健二 昭和大学, 歯学部, 教授 (50275343)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 骨格成長 / エキソソーム / シグナル伝達 / 亜鉛トランスポーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、軟骨代謝機構におけるZIP10(亜鉛トランスポーター)の役割解析を目的とし、特に細胞から分泌されるエキソソームの関与について解析を行っている。前年度までにCre-loxPシステムを用いた骨・軟骨特異的ZIP10欠損マウスの解析から、胎生から成獣に至るまで四肢の短縮を伴う骨格形成異常や顎顔面骨の形成異常が確認され、ZIP10は必須微量因子である亜鉛の細胞内調節を担い、骨格形成に必須の因子であることが示唆された。また、Type I collagen あるいはType XI collagen プロモーター下流でCreを発現するZIP10欠損マウス（Zip10cKO）から骨芽細胞および関節表層細胞、軟骨細胞を採取し、RNA-sequence法を用いた網羅的発現解析の解析を行った。その結果、Zip10の発現低下に対して、高発現変動を示すZipファミリーが検出され、その中には、骨代謝調節が示唆されているZip13が含まれていた。一方で、Gene Ontology 解析から、ZIP10を欠損した骨軟骨細胞では、Vesicle (微小小胞体) や 細胞外小胞体/エキソソームに関わる遺伝子群の変動が高く、亜鉛が小胞輸送やタンパク分泌を制御する可能性が示唆された。また、細胞死に関わる遺伝子群や、細胞分化など細胞形質に関わる遺伝子群の発現変動が確認されたことから、エキソソームを介した制御について解析している。今年度は、特に、エキソソームを介した機能調節を解析するため、培養上清中に含まれるエキソソームの回収と機能解析を行った。初代培養細胞から回収されるエキソソーム量が少量のため、効率的に欠損マウスを得るため、タモキシフェン誘導性のZip10 欠損マウスを作製した。このマウスから骨軟骨細胞を採取し、単離培養細胞からのエキソソームの回収を行い、タンパクの網羅的な発現解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
当初の計画書におけるマウスでは、致死率が高かったため、in vitroの実験を進める上での遺伝子欠損マウスの確保のため、全身でCreERを発現するマウスを用いたZip10欠損マウスの作製を行った。マウス繁殖制限下で、計画に遅れが生じているが、実験を前後しながら計画にそって実験をすすめている。
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| Strategy for Future Research Activity |
培養系でタモキシフェン 誘導により欠損表現系を実現できるCreER:Zip10fl/flマウスを作製することで、計画書における作製マウスの致死率の回避を試みた。このマウスを用いて、１つの個体から、未分化間葉系幹細胞や骨芽細胞、軟骨細胞を採取でき、初代培養の培養中に形成されたExosomeの回収を行いExosomeのLC-Massによる網羅的蛋白解析に着手している。
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| Causes of Carryover |
今年度は、実験に必要なマウス繁殖制限下で、計画に遅れが生じた。次年度は、Exosomeの回収とLC-Massによる網羅的蛋白解析およびin vitroの実験を進めていく上での必要経費に算入することとした。
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